基因克隆及转基因方法.docVIP

基因克隆及转基因 基因克隆及转基因过程 设计引物 软件是DNASTAR.Lasergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter?New?Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法有哪些信誉好的足球投注网站R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中有哪些信誉好的足球投注网站R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、有哪些信誉好的足球投注网站完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 提取醋栗DNA PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul； 10乘Taq buffer2.0ul； 引物F、R各0.5ul； 模板1ul；若为质粒0.5ul就够； 最后加入Taq酶0.2ul，Taq酶现用现拿。 过程：我们用的是预变性94℃3min； 然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性94℃30s，退火 退火温度下30s，延伸72℃时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb； 循环完成后， 此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72℃延伸； 最后4℃保存待用。 4、双酶切 回收没问题就将回收的目的基因和表达载体质粒进行双酶切。 目的基因回收完可以直接用试剂盒提纯，因为就切下来很少的几个碱基，试剂盒柱上挂不住。 表达载体质粒酶切完要琼脂糖凝胶回收，回收大的片段。 回收完检测一遍。 连接 大肠杆菌转化 大肠杆菌感受态用的是DH5α。 步骤： 打开42℃水浴锅。 把感受态放在冰上化，不能放太久，，将质粒（连接产物）加感受态细胞50ul，指尖混匀。 在冰上放30~40min。 90s严格计时，放入水浴锅热激（42℃），之后立即放冰上1~2min，之后加入500ul纯净LB液体培养基（37℃最好），混匀。 放入37℃摇菌箱，45min~1h（180~200rpm）（这一步的目的是菌恢复活性）。 离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素的固体培养基）。 放入37℃培养箱，倒置。 涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。 挑菌及摇菌 长出单菌落后，超净工作台里挑菌，将菌挑在20ul的灭菌水中作为模板进行菌落PCR。将检测没问题