第8章离子交换法.ppt

（三）、样品的准备 100mg蛋白质/10ml床体积。 样品体积不超过0.5个床体积。 * （四）、上样和洗脱 样品均匀平整地加到床面上； 上样前应先加5ml洗脱液。 用洗脱缓冲液淋洗，pH梯度自动形成。 梯度的pH上限由起始缓冲液确定，其下限由淋洗缓冲液的pH决定。 * 去除多缓冲剂的方法 （1）沉淀法 （2）凝胶过滤 （3）亲和色谱法 （4）疏水色谱法 * 多缓冲离子交换剂的再生 多缓冲交换剂的再生可以在柱上进行。 用2~3个床体积的1mol/L NaCl淋洗。 用0.1mol/L HCl洗涤。 * * 五、应用实例-蛋白质模拟混合物分离 PBE94柱，床高15cm。 样品:4ml洗脱缓冲液含有马肌红蛋白，碳酸酐酶和白蛋白. 起始缓冲液:0.025mol/L咪唑HCl，pH7， 洗脱缓冲液：多缓冲剂74，pH4。 * 离子交换剂 弱酸阳离子交换树脂 724。 强酸阳离子交换树脂 732。 强碱阴离子交换树脂 717。 CM-C DEAE-C CM-Sephadex C DEAE-Sephadex A ？-Sepharose A （聚焦色谱PBE94 ） * 无盐水制备 阳离子交换树脂用强酸性树脂，阴离子交换树脂可以用强碱或弱碱树脂。 强酸——弱碱 或 强酸——强碱； 当对水质要求高时，经过一次组合脱盐，还达不到要求，可采用两次组合: 强酸——弱碱——强酸——强碱； 强酸——强碱混合床。 * 混合床 混合床系将阳、阴两种树脂混合而成，脱盐效果好。 混合床中所发生的反应: * 混合床－无盐水 * 图8.20 混合床的操作 (a)为水制备时的情形； (b)为制备结束，用水逆流冲洗。阳、阴树脂根据比重不同分层，一般阳树脂较重在下面，阴树脂在上面； (c)为上部、下部同时通入碱、酸再生，废液自中间排出； (d)为再生结束，通入空气，将阳、阴树脂混合、准备制水 混合床－抗生素脱盐 经过第一柱（阳树脂）时，溶液变酸，而经过第二柱（阴树脂）时，溶液又变碱。 链霉素脱盐：强酸1×25和弱碱311×4树脂组成混合床，脱盐效果较好。 * 第八节 新型离子交换剂 一、大孔、均孔树脂 （一）大孔型离子交换树脂（macro porous ,MP） （二）均孔型离子交换树脂 ( IR ) 二、多糖基离子交换剂 （一）离子交换纤维素 （二）葡聚糖凝胶离子交换剂 * 大孔型与凝胶型离子交换树脂物理性质 * （一）大孔型离子交换树脂的特征 （1）载体骨架交联度高。 （2）孔径大。 （3）表面积大，表面吸附强，对大分子物质的交换容量大。 （4）孔隙率大。 * 大孔型离子交换树脂主要特性 * （二）均孔型离子交换树脂 主要是阴离子交换树脂。 骨架的交联度比较均匀。代号为IP或IR。 交联度均匀，孔径大小一致，交换容量都较高，膨胀度、机械强度好。 * 二、多糖基离子交换剂 生物大分子对离子交换的要求: 固相载体具有亲水性和较大的交换空间; 对其生物活性有稳定作用，并便于洗脱。 生物来源稳定的高聚物——多糖作载体。 多糖基离子交换剂可以分为： 离子交换纤维素 葡聚糖离子交换剂 * （一）离子交换纤维素特点： (1)开放的长链骨架，亲水性强，表面积大，易吸附大分子。 (2)交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大。 (3)吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不宜变性。 (4)分辨率高。 * 常用的离子交换纤维素 羧甲基纤维素（CM-C）：弱酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6 。 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C）：强碱型阴离子交换纤维素，pK=9.1。 * * 离子交换纤维素的制备 * 操作注意点 可静态交换，也可动态交换。 交换基团密度低、吸附力弱。 盐浓度不宜高（控制在0.001~0.02 mol/L）。 * 离子交换纤维素的选择—解离曲线 * 离子交换纤维素的解吸 洗脱缓和。 升高环境的pH、降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。 * 离子交换纤维素的处理和再生 酸碱浓度要适当降低，处理时间也从4h缩短为0.3~1h。 以交换缓冲液平衡。 注意： 不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制。 * （二）葡聚糖凝胶离子交换剂 是将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂 。 命名: 交换活性基团-Sephadex C (A)-编号。 具有离子交换和分子筛的双重作用，对生物分子有很高的分辨率。 * 常用的离子交换葡聚糖 * 琼脂糖凝胶离子交换剂 琼脂糖凝胶上引入功能基 DEAE —sepharose CL-6B CM —sepharose C