RNA文库建立的详细版SOP--陆芳.doc

RNA文库构建SOP操作流程 Ⅰ样品质检 本实验仪器与试剂： 电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、nanodrop、掌型离心机、微波炉 琼脂糖、1xTAE缓冲液、Rnase-Free water、Maker DL2000 实验流程： 首先观察客户提供RNA样品是否足量(目测样本体积不少于20ul)。如果足量，取4ul至新EP管中，用来进行质检，剩余样品进行封口，于-80°冰箱里储存。 取1ul样品进行nanodrop定量，确定浓度。如果浓度超过1000ng/ul，要稀释至500ng/ul左右，重新检测浓度。 电泳检测：上样2-3ul跑胶检测。 实验结果： OD值要在1.8-2.0之间，证明没有蛋白污染或RNA降解。 胶图上要有28s，18s，5s三条带。 胶图如下： Ⅱ提取mRNA 本实验所用仪器与试剂： 超净台、PCR仪或水浴锅、磁力架 Magnetic mRNA Isolation Kit 实验流程： 1.准备磁珠 取100ul Oligo d(T)磁珠至干净的Rnase Free的1.5ml离心管中，放磁力架1min，待液体澄清后，保持离心管在磁力架上，弃上清，再加入500ul的Binding Buffer，轻轻摇晃混匀两分钟进行清洗。放在磁力架1min，待液体澄清后，弃上清，加入500ul Binding Buffer以备用（在加入样本之前弃上清）。 2、 根据浓度确定建库加入量，范围在5-15ug。确定样品量后，向样品中加入500ul Binding Buffer，准备好的磁珠里加入样品，轻轻混匀，常温孵育10min。然后将离心管放磁力架上1min，吸附磁珠，待液体澄清后，吸取上清于新的EP管中（不能完全吸走，留部分液体保存磁珠）。 3、上述离心管中加入500ul Wash buffer1，混匀1min。然后将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，弃上清。重复一次此步骤。 4、上述离心管中加入500ul Wash buffer2，混匀1min。然后将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，弃上清。重复一次此步骤。 5、上述离心管中加入500ul Low Salt buffer，混匀1min。然后将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，弃上清。 6、上述离心管中加入18-100ul Elution buffer（或者Nuclease-Free Water），轻轻颠倒使珠子悬浮。然后50℃孵育2min（水浴），立即放在冰上（2min以上）。将离心管放磁力架1min，吸附磁珠，待液体澄清后，取上清至新的RNase-free PCR管中，置于冰上，立即定量或-80℃冰箱保存。 7、 Ⅲ mRNA片断化及抽提 本实验所用仪器及试剂： 超净台、PCR仪、冷冻离心机、-80℃冰箱 NEBNextTM mRNA Sample Prep Reagent Set 1试剂盒、Ethanol（100%、70%） 3M sodium acetate PH5.2 (配1ml所需Sodium Acetate0.2487g) 实验流程： 将PCR仪预热至94℃，将下列各组分混在一个RNase-free PCR管中： 试剂 体积 Purified mRNA 18ul 10XRNA Fragmentation Reaction Buffer 2ul Nuclease-free Water Variable Total 20ul 将上述体系轻轻混匀，震荡离心。然后94℃孵育5min（热盖严格按照时间），使mRNA断裂成200pb左右的片段，放置冰上5min。然后加入2ul 10XRNA Fragmentation Stop Solution，用枪吹打混匀，终止片段化反应。 将下列各组分混在一个RNase-free 1.5ml离心管，冰上操作： 试剂 体积 Fragmented m RNA 22ul 3 M Sodium Acetate,pH5.2 2ul Linear Acrylamide,10mg/ml 2ul 100% Ethanol 60ul Total 86ul . 混匀后放入-80℃孵育30min，离心机预冷至4℃； 冷冻离心机4℃， 12000rpm离心25min.，小心弃去乙醇。 加入70%乙醇300ul，小心吹打管底固体，4℃， 12,000rpm离心10min，小心弃去70%乙醇。 在室温下风干10min,挥发残留乙醇，重新加入13.5ul Nuclease-Free Water溶解mRNA。. Ⅳ cDNA第一条链的合成 本实验所用仪器及试剂： 超净台、PCR仪、掌型离心机 NEBNextTM mRNA