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基因的转移;第一节 基因转移的概念 第二节 宿主细胞与条件 第三节 重组体导入原核细胞 一、转化 二、受体细胞 三、感受态大肠杆菌的制备 四、转化：重组DNA导入大肠杆菌;第一节 基因转移的方法;1. 接合作用 conjugation;图 F质粒 (F因子)接合作用 ;2. 转化作用 transformation;图 转化作用;3. 转导作用 transduction;体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每?g ?DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及重组。 ;图 转导作用;① 体外包装 in vitro packaging 定义：将重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。;② 体外包装的方法与过程 ;③ 转导;4. 转染 transfection;二、基因转移的目的;第二节 受体/宿主细胞;二、受体细胞必须符合的条件;三、 E.coli受体细胞;2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它;图 常用 E.coli 菌株;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;第三节 重组体导入原核细胞;3. 转化率;（3）转化率的计算;; 转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打“洞”，让外源DNA进入细胞内。;（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的通透性改变，允许外源DNA 进入。;3. 感受态假说;1. CaCl2的作用 改变细菌质膜通透性，允许DNA进入。 2. 操作程序 ?挑单菌落置培养基中。 ?过夜培养，至OD600=0.3 ~0.5 。 ? 冰浴10 min。4℃离心，去培养液。 ?冰冷的0.1molCaCl2 悬浮菌体。 ?冰浴10 min 。4℃离心，去培养液。 ?冰冷的0.1molCaCl2 ???悬浮菌体。 ?分装，-70 ℃冻存。;3. CaCl2法的优点;图 制备感受态E.coli的过程;（三）转化：热休克法 heat shock; ;图 细菌的平板培养;（四）影响转化率的因素;2. 感受态细胞的生长状态和密度;2. 感受态细胞的生长状态和密度;3. 试剂的质量要高;4. 无菌操作，防止污染;第四节 外源基因导入酵母细胞;酵母的克隆和表达载体有4种类型： YIP（整合型质粒） YRP（复制型质粒） YEP（附加体质粒） YCP（着丝点质粒）。 其中，YEP附加体类质粒，含有2um质粒，是构建酵母表达质粒载体中最常用的。;三、LiCl 转化法; 酵母;四、原生质体转化法;图 原生质体转化法;第五节 外源基因导入动物细胞;2. 转染的技术或方法;;二、 磷酸钙共沉淀法;图 磷酸钙沉淀法;三、二乙氨乙基-葡聚糖法;DEAE-dextran;四、脂质体法 lipofectin;图 脂质体法 lipofectin;五、电穿孔法 electroporation;主要影响因素;LB培养细菌至OD600=0.6;六、 显微注射法 microinjection;图 显微注射卵母细胞;