PTEN、P16、Rhoc基因表达及骨肉瘤关系.docVIP

PTEN、P16、Rhoc基因表达及骨肉瘤关系摘 要:目的:研究PTEN、P16、Rhoc基因表达与骨肉瘤的关系。方法:选取20例骨肉瘤患者和20例骨软骨瘤患者,用免疫组化SP法检测PTEN蛋白的表达;RT-PCR法检测P16、Rhoc mRNA的表达。结果:PTEN蛋白和P16 mRNA在骨软骨瘤中的表达分别为123.00±9.26和0.80±0.02,显著高于骨肉瘤中的57.75±8.30和0.36±0.11(P0.05);Rhoc mRNA在骨肉瘤中的表达为0.93±0.04,高于骨软骨瘤中的0.54±0.05(P0.05)。结论:PTEN、P16、Rhoc与骨肉瘤的发生、发展以及侵袭、转移有关,且三者具有相关性。临床上联合检测PTEN、P16、Rhoc的表达对骨肉瘤的早期诊断、预后判断具有指导意义。 关键词:骨肉瘤;PTEN;P16;Rhoc 中图分类号:R730.231+3文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0018-02 骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,预后差,是严重影响青壮年健康的恶性肿瘤。传统治疗方法如手术切除、截肢加辅助化疗,创伤大,存活率低。其病因和发病机制迄今尚不清楚,因此,在基因水平上了解骨肉瘤的发生、发展,对于更好地选择治疗方法具有重要意义。我们运用免疫组化法和RT-PCR法,检测骨肉瘤中PTEN、P16、Rhoc的表达水平,探讨其在骨肉瘤发生发展中的作用机制,以期为骨肉瘤的临床诊断和治疗提供参考。 1 资料与方法 1.1 研究对象 骨肉瘤标本分别来自20例骨肉瘤手术治疗患者,其中男13例,女7例;年龄10-50岁,平均27.1岁。根据WHO骨肉瘤分类标准,一般型10例,成软骨型2例,成纤维型1例,血管扩张型3例,髓内高分化型1例,恶性纤维组织细胞瘤型1例,骨旁骨肉瘤1例,小细胞型1例;组织学分级:高分化(Ⅰ～Ⅱ级)14例,低分化(Ⅲ级)6例。以同期收检的20例骨软骨瘤手术切除标本作为对照。标本于手术切下后分别置于液氮中保存;甲醛固定,常规石蜡包埋,3μm连续切片。 1.2 检测试剂及方法 采用免疫组化SP法。鼠抗人PTEN单克隆抗体及SP试剂盒均购自北京博奥森生物技术公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。每例均随机观察8个高倍视野,读取阳性细胞数。 Trizol试剂购自美国invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。根据登录GenBank中检索人P16、RhoC基因已知序列,应用Priemer5.0软件设计引物碱基对序列,由宝生物工程(大连)有限公司合成。总RNA提取及逆转录和PCR各操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。 1.3 统计学处理 用SPSS11.0软件进行数据分析,指标测定结果计量资料以x±s表示,采用t检验。P0.05为组间差异有统计学意义。 2 结果 2.1 PTEN在骨肉瘤及骨软骨瘤中的表达 PTEN阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞浆,亦为棕黄色颗粒。结果见表1。 2.2 P16、RhoC mRNA的表达结果 骨肉瘤组P16产物电泳条带暗、产量低,RhoC产物条带强、产量高。结果见表2。 3 讨论 P16是一种新型抑癌基因,位于人类染色体9P16区,与细胞周期调节密切相关,该蛋白是CDK4的抑制因子,通过与细胞周期蛋白D1以竞争方式结合CDK4,抑制CDK4的活性,使细胞停滞于G0期和G1期,抑制细胞分裂增殖。CDK4可能通过调节多种底物的磷酸化,是G1-S期和G2-M期转换的关键。体外研究证实,P16蛋白能特异地抑制CDK4的活性。细胞周期蛋白D表现某种癌基因的作用,当其过度表达时,细胞便会向癌变发展。细胞周期蛋白D同CDK4结合时,可刺激细胞生长分裂;P16与CDK4结合时,致使其磷酸化活性降低,引起Rb磷酸化而导致肿瘤细胞死亡[1,2]。可见P16既是细胞周期固有的调控者,又是抑制肿瘤生长的关键成分。 PTEN基因位于人类10q23,是近年来发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,其活性的改变与多种肿瘤的发生有着密切的关系。PTEN基因编码的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用,可负向调节PI3K/Akt信号通路,对抗PI3K途径转导的生长和生存信号,抑制肿瘤的发生和发展。刘伟等[3]对43例非小细胞肺癌组织和20例癌旁正常肺组织PTEN表达情况的研究显示,PTEN在肺癌组织中的表达率为46.5%,而在癌旁组织中的表达率为95.0%,两组间比较有显著性差异。Levine等[4]报道,在犬的骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中都可看见PTEN蛋白表