GUS活性检测mod - 中科瑞泰.PDF

中科瑞泰 （北京）生物科技有限公司 Tel: 01082598075 Fax : 010 http:// E-mail: real-times@163.com 用较为广泛的报告基因是GUS 基因，它来自于大肠杆菌，编码 -葡萄糖醛酸乙酰转 移 酶 。 该 酶 与 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 - -D- 葡 萄 糖 苷 酸 酯 (5-bromo-4-chloro-3-indoyl- -D-glucuronic acid, X-Gluc)底物发生作用，产生蓝色沉淀反 ，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。检测容 易、迅速并能当量。只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。 1.GUS 酶活性检测 gus 基因 在于某些细菌体内，编码 -葡萄糖苷酸酶 （-glucuronidase，GUS），该 酶是一种水解酶，能催化许多 -葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不 在内源的GUS 活性，因此gus 基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基 因瞬时表达的转化实验中广泛 有。此外，gus 基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够 正常表达，所产生的融合蛋白仍具有GUS 活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提 供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。 主要有以下三种检测方法： （1）组织化学染色定位法 该法以5-溴-4-氯-3-吲哚- -D 葡萄糖苷酸酯 （X-Gluc）为底物，通过显色反 可直接观 察到组织器官中 gus 基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被 测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保 ，若组织、 细胞、原生质体发生了gus 基因转化，表达出 GUS，在适宜条件下该酶可将X-Gluc 水解 生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成 5,5’- 二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有GUS 活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或 在显微镜下观察到。 （2 ）荧光法测定GUS 活性 该法以 4- 甲基伞形酮酰- -D-葡萄糖醛酸苷酯 （4-MUG）为底物，GUS 催化其水解为 4- 甲基伞形酮（4-MU）及 -D 葡萄糖醛酸。4-MU 分子中的羟基解离后被365nm 的光激发， 产生455nm 的荧光，可用荧光分光光度计定量。具体测定时有两种做法: 仅在一个时间上 测定溶液的总荧光量，测定时要设对照，以消除内源荧光强度；②测定酶反 不同时间溶液 荧光量 （荧光法十分灵敏，微小的增加量也可以测定出来），在酶反 初始阶段，酶作用生 成的荧光物质在反 体系中处于积累阶段，荧光产物与时间有线性关系，而内源性荧光物质 的荧光量与时间无此种关系，因而可通过测定酶反 初始阶段几个时间的荧光量，得到的线 性关系即可作为酶活力的依据。 （3 ）分光光度法测定GUS 活性 对硝基苯 -D-葡萄糖醛酸苷 （PNPGluc）是该法的最好底物，GUS 将其水解，生成对 硝基苯酚，在pH7.15 时离子化的发色团吸收400～420 的光，溶液呈黄色，酶反应在pH7.0 条件下进行，随反 进行，产物生成，逐渐碱化，显色增强。以对硝基苯酚为标准样品，分 别在反 开始后不同时间取样，终止反 后于415nm 测吸收值。这种方法简单，无需复杂 仪器，但其灵敏度不 ，可通过延长反 时间来增强显色。 X-Gluc 母液配制 20 mg/ml (38mM) X-Gluc. e.g. For a 1.5 ml tube (microfuge tube) dissolve 30 mg of X-Gluc in 1.5 ml DMSO (dimethyl sulfoxide) or DMF(N,N-dimethylformamide)，避光-20℃