磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠这种磁珠微珠的表面标记.PDF

磁珠法核酸纯化技术采用 了纳米级磁珠微珠 ，这种磁珠微珠 的表面标记 了一种 官能 团，能 同核酸发生 吸 附反应 。硅磁 （Magnetic Silica Particle）就是指磁珠微 珠表面包裹一层硅材料 ，来 吸 附核酸 ，其纯化 原理类 型于玻璃奶 的纯化方式 。离 心磁珠是指磁珠微珠表面包裹 了一层可发生离心交换 的材料 （如 DEAE，COOH） 等 ，从而达 到吸 附核酸 目的。不 同性质 的磁珠微珠所对应 的纯化原理是不一致 。 使用磁珠法来纯化核酸 的最大优 点就是 自动化 。 磁珠在磁场条件 下可 以发生 聚集 或分散 ，从而可彻底摆脱离心等所 需 的手工操作流程 。Omega 拥有全面 的磁珠法 核酸分离试剂盒 ，基于这种技术 的试剂盒 ，名称前都有 ’Mag­Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。 核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、 多糖、 脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整 性;排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质 分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。  1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学 作用、酶作用等方法实现。  (1)  机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。 这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长 链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从 500bp  ～   20kb  之间,而颗粒 匀浆法提取的核酸一般 10kb。  (2)  化学作用:在一定的 p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水 相。 上述变性条件可通过加热、 加入表面活性剂(SDS、T riton X­100  、T ween 20  、NP­40    、  CTAB、sar­cosyl  、Chelex­100  等)  或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)  而获得。 而 p H 环境则由加入的强碱(NaOH)  或缓冲液  ( TE、STE  等)  提供。在一定的 p H  环境 下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合 剂( EDTA  等)  可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+  、Ca2  + ,从而抑制核酸酶的活 性,保护核酸不被降解。  (3)  酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶 K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)  以使细 胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催 化细菌细胞壁的蛋白多糖 N­乙酰葡糖胺和 N­乙酰胞壁酸残基间的 β­(1 ,4)  键水解。蛋白酶  K 能催化水解多种多肽键,其在 65  ℃及有 EDTA、尿素(1～4mol/ L)  和去污剂(0. 5 %SDS  或  1 %Triton X­100)  存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实 际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据 细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。  2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离 与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶 K  或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶  (DNase  和 RNase) ,DNase  和 RNase  也用于去除不需要的核酸。 3. 核酸的分离与纯化:核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子 物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将 核酸分离、纯化。(1) 酚提取/  沉淀法:核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂 解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿 ∶异戊醇(25  ∶24  ∶1  体积)  混合液。 依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸)  或简单颠倒混匀(适用于分 离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。 酚是一种有机溶剂,预先要用 STE  缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核 酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中