第2章(2学时)细胞培养微载体.pptVIP

生物工程下游技术Downstream Technique of Biotechnology 动物细胞专用微载体 起始： 动物细胞专用微载体 动物细胞培养的展望 动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。 发展趋势：从国际上动物细胞培养技术的发展趋势看，主要有6个方面发展方向： （1）开发细胞培养反应器和培养系统 （2）开发培养贴壁细胞的载体； （3）开发微囊技术； (4) 开发杂交，重组技术； (5)开发无血清和化学合成的培养基； （6)蛋白质浓缩和提纯技木。 动物细胞专用微载体 一、微载体 概念：所谓微载体是指直径在60-250μm，能够适用于贴壁细胞生长的微殊。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 历史：1967年Van Wezel 首先开发微载体培养动物细胞，当时选用阴离子交换树脂Sephadex A50研制的第一种微载体培养动物细胞并获得成功。其后Van Hemert及Whiteside也相继作了培养BHK21等细胞及生产口蹄疫苗的报道。 动物细胞专用微载体 微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。 微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附 及生长，密度可逐渐增大。 种类： 国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 动物细胞专用微载体 优点： 自此以后微载体培养动物细胞得到迅速的发展。采用微载体培养有以下优点： （1）表面积/体积(S/V) 大。如1.0g Cytodex 1微载体能提供5000一6000cm2表面积，以1.0g微载体/m1培养基浓度计，表面积/体积培养基达5cm2，足够( 750-1000)xl06个细胞生长，若提高微载体浓度，细胞产率会更大。因此它的单位体积培养基的细胞产率高， （2）由于采用均匀悬浮培养，把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，具有两种培养优点，简化了细胞生长各种环境因素的监测和挖制，培养系统重现性好。 动物细胞专用微载体 (3) 用简便的显微镜观察即能监测出细胞在微珠生 长情况． (4)培养基利用率高。 (5)收茯细胞过程不复杂。 （6）放大容易，国外已发展到l000L规模培养生产 β-干扰素用的人体二倍体细胞。 (7)劳动强度小。 (8)培养系统占有空间小。 由于微载体培养细胞具有以上优点，是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。 动物细胞专用微载体 第二节 动物细胞在微载体上贴壁生长机理 一、机理： 贴壁依赖动物细胞在微载体表面上增殖，可分力贴壁、生长和扩展成单层3个阶段。 1、贴壁 细胞能否在微载体表面贴附，决定因素为： （1）一是取决于细胞与微载体接触的几率，即提高细胞与微载体上的接触的机率。 动物细胞专用微载体 原理： 理论上可以采用增大搅拌转速从而提高两者碰撞频率来实现、 而实际上，对动物细胞来说，这种方法是行不通的，因为动物细胞与霉菌、细菌、酵母细胞不同，后者有一层坚韧的外壁，能承受较大的剪切力，而前者只包含一层原生质，细胞结构脆弱，稍大一点剪切刀甚至碰撞都可能招致细胞损伤。 另一方面，即使在高转速下，提高了细胞与微载体接触的几率，但也相应缩短细胞贴壁所需时间导致细胞来不及贴壁即被湍流流体带走。 动物细胞专用微载体 方法： 一般操作方式为在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停，经数小时后，待细胞附着于微载体表面，维持设定的低转速，进入培养阶段。 动物细胞专用微载体 （2）二是取决于细胞与微载体的相融性，这又与基质表面的化学物理性质相关。 细胞能否迅速贴附在微载体表面也与微载休表面的物理化学性质有关。 原理： 一般脊椎动物细胞在生理pH值下表面都带有分布不均匀的负电荷，按照一般的慨念似乎微载体表面要带正电荷方能加快细胞的贴壁速度， 动物细胞专用微载体 但实际情况并不完全如此。因为控制细胞贴壁速度的基本因素是微载体表面的电荷密度而不是表面极性， 1）如微载体表面带的是正电荷，则由于静电相吸作用，使细胞容易贴在微载体表面上，但如表面电荷密度过大则反而产生“毒性”效应。 2）如微载体带的是负电荷，则由于静电相斥，使细胞难以贴壁。但如培养基中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作媒介，带负电荷的细胞也能贴附在带负电荷的微载体表面。 动物细胞专用微载