基因敲除技术发展史简概.PDF

医学研究与发表 【精品长篇】 基因敲除技术发展史简概 Nanfang Peng 基因敲除在研究某个基因功 能以及永久改变细胞表型的过程 中是一个关键技术。其在生命科 学研究以及临床上特别是遗传病 的治疗方面都具有令人激动的广 阔前景，因此科学家对其的研究 探索一直保持高度热情。目前为 止，已有的各种基因敲除技术在 敲除效率、完成时长以及脱靶效 率方面存在差别。 由于缺乏快速地靶定和敲除 特定基因的方法，早期基因敲除 在基础研究、功能基因组学以及 细胞系工程中没有广泛应用，科 学家多应用非特异性靶定的方 法，如电离辐射、化学物质来诱 导体细胞全基因组的随机突变； 一、锌指核酸内切酶 (zinc- 锌指最开始是在Xenopus 随后，科学家采用特异性的同源 finger nucleases，ZNF) 中发现的在Mtazoa 中最常见的 重组来获得某基因突变，但是在 DNA 结合基序。每一个指状蛋白 这个方法中，哺乳动物细胞系发 在哺乳动物细胞中，双链 α 能够通过 螺旋识别3-4 对DNA 生随机整合的概率远远高于特异 DNA 断裂后通过同源介导的修复 碱基对，因此，多个指状结构可 性的同源重组，故后续试验中需 （homology directed repair, HDR ） 以随机连接起来从而高度特异性 要采用数月来筛选数以千计的克 或者非同源末端连接(nonhomol- 地识别大量不同的DNA 序列。 隆以获得双等位目的基因敲除的 ogous end joining, NHEJ）来修 Chandrasegaran 实验室研究发现， 克隆；此外，腺病毒运载系统也 复损伤部位，两者发生的概率比 由锌指蛋白DNA 结合结构域（此 被应用于基因组学研究，但是其 约为9:13。目前为止，科学家发 区域特异性地结合在DNA 目的区 在获得双等位目的基因敲除克隆 现，在果蝇、植物、线虫以及哺 域）以及Type ⅡS 限制性内切酶 上的效率低、时间长，严重阻碍 乳动物细胞中，位点特异性的锌 的非特异性剪切结构域Fok Ⅰ融 其被广泛应用。随后一系列特定 指核酸内切酶能够造成双链DNA 合可以形成锌指核酸内切酶。锌 靶基因敲除技术的发现及成熟， 断裂，并最终通过同源重组或者 指核酸内切酶Fok Ⅰ结构域的二 大大推动了生命科学和临床医学 非同源末端连接获得目的基因突 聚化为DNA 结合结构域发挥功 的发展。 变体。 能所必须，因此在通过锌指核酸 2017年3月 第3卷 第1期 3 【精品长篇】 医学研究与发表 内切酶构建稳定敲除的突变体的 2. 锌指蛋白核酸内切酶介导的 及其DNA 分子导入细胞中的 过程中，需要设计成对的锌指核 基因组敲除可以帮助科研工 方式有限； 酸内切酶用于精准地靶定在特异 作者选择性地删除内含子等 5. 锌指蛋白核酸内切酶自身的 的目的基因序列实现锌指核酸内 非编码的基因结构，从而更 免疫原性使得其在临床治疗 切酶的二聚化以及DNA 剪切。其 为精确地定位其生物学功能； 中需要考虑其会引起的机体免 具体过程为：通过在细胞内瞬时 3. 锌指蛋白核酸内切酶介导的