利用微卫星标记进行白鹭个体识别的研究 - 厦门大学学报（自然科学版）.DOC

白鹭脱落羽毛的微卫星个体识别研究 管昊1, 林清贤1，2, 周晓平1，2, 方文珍1，2, 陈小麟1，2(* (1.厦门大学 生命科学学院；2.厦门大学 环境与生态学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室, 福建 厦门361102) 摘要：本研究利用鹭科鸟类已有微卫星引物进行跨种扩增筛选，获得12对可用于白鹭（Egretta garzetta）的微卫星引物，结合非损伤采集的脱落羽毛样品，在物种分子鉴定和性别分子鉴定的基础上，建立适用于羽毛样品个体识别分析的微卫星基因分型技术体系.在中国沿海的3个白鹭繁殖种群的181样品中，19个羽毛样品由于DNA质量较差未能有效鉴定物种. 119个羽毛样品成功地鉴定为白鹭个体，物种鉴定结果可重复率达93.8%. 性别鉴定结果可重复率94.1%，119个白鹭羽毛样品当中的28.57%为雄性. 基因分型得到各个位点的等位基因数7-22个，观察杂合度和期望杂合度分别为0.623-0.875和0.779-0.918，没有位点偏离哈迪-温伯格平衡，基因分型错误率为1.2%. 个体识别分析发现其中的2个样品为相同基因型，为重复采集自同一个体脱落的不同羽毛. 本研究结果将为深入研究白鹭种群遗传结构、扩散模式等保护遗传学问题奠定了基础，并且能够为其他鹭科鸟类的脱落羽毛的物种鉴定、性别鉴定、个体识别提供参考. 关键词：白鹭；羽毛；微卫星；个体识别；基因分型 中图分类号：Q953，Q959.7 文献标识码： A 动物种群遗传学研究的关键工作之一就是对每个个体进行个体识别，建立个体标签库[1].利用脱落羽毛、毛发或粪便等非损伤性采集的样品进行基因分型和个体识别，不仅样品采集过程不会对动物造成伤害，而且可简化采样过程，有利于迅速收集到大量的样品，因此在鸟类等不易捕捉动物的种群遗传研究中日益受到广泛应用[2-4]. 白鹭（Egretta garzetta）属于鹳形目（Ciconiiformes），鹭科（Ardeidae），鹭亚科（Ardeinae）的白鹭属（Egretta）[5]，是广泛分布于全球各地淡水或咸水湿地的涉禽. 数十年来，由于其对于生态环境的指示作用，白鹭被广泛应用于生态毒理学、环境监测等方面的研究，如Chokri等观测分析了白鹭在突尼斯 Sfax盐沼地的营巢地址选择与繁殖成功率相关关系[6]；Malic等研究了白鹭羽毛在巴基斯坦不同地区中的多氯联苯醚含量及其影响[7]. 对于白鹭繁殖生态学方面的研究也较多，如在福建厦门、湖南花盐溪等地白鹭种群的繁殖习性研究[8-11]. 也有一些学者进行了白鹭遗传学方面的研究，如江杉等研究了扩增性别基因片段的鹭类性别鉴定方法[12]，林清贤等研究了包括白鹭在内的中国6种白色羽鹭科鸟类的分类系统归属[13]，Li等研究了白鹭等鹭科鸟类的组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）基因特点[14]. 近年来，微卫星（microsatellite）标记逐渐被应用于鸟类种群遗传学研究. 微卫星是指基因组中由短的重复单元(一般为1～6个碱基)组成的DNA串联重复序列，或称简单重复序列(simple sequence repeats, SSR) [15]. 鹭科鸟类的微卫星标记研究报道如黄嘴白鹭(Egretta eulophotes)[16, 17]及棕颈鹭（Egretta rufescens）[18, 19]. 但是，目前对于白鹭种群的遗传学研究方面如微卫星标记、个体识别、亲缘关系鉴定等尚处于空白阶段. 在野外，白鹭经常和池鹭（Ardeola bacchus）、牛背鹭(Bubulcus ibis)、黄嘴白鹭、大白鹭（Ardea alba）等鹭科鸟类混群营巢[20]，这些鹭类物种的白色羽毛在外形上难以区分. 另一方面，世界上50％，限制性片段长度多态性聚合酶链反应. 针对前文所述问题，本研究利用在鹭科鸟类巢区内非损伤性采集的自然脱落白色羽毛，应用分子生物学技术对羽毛样本进行物种鉴定，并对鉴定为白鹭物种的羽毛样本进一步进行性别鉴定，然后，利用微卫星分型技术对白鹭物种的全部羽毛样本进行个体识别，由此建立白鹭脱落羽毛的物种鉴定、性别鉴定、个体识别的方法体系，为白鹭及其它鹭科鸟类的种群遗传结构、迁移模式、分子行为生态等保护遗传学研究奠定基础. 1 材料与方法 1.1材料 肌肉组织样品：引物筛选所用的20个肌肉组织样品分别来自福建省厦门市（8只白鹭雏鸟）、漳州市（7只白鹭雏鸟）和泉州市（5只白鹭雏鸟），20只白鹭雏鸟均为2008-2010年白鹭繁殖期间的野外死亡个体. 羽毛组织样品：种群遗传研究所用的181支羽毛的组织样品分别来自广西防城港、福建厦门和浙江舟山的3个繁殖种群（表1）. 采样时间为2009-2010年的白鹭繁殖期，拾取白