Biacore T200 简易操作指南.PDF

Biacore T200 简易操作指南 一、Biacore T200 设备介绍 分子相互作用分析系统Biacore 是由仪器主机和电脑两部分组成。 仪器开关在主机右后方，仪器正面左侧为缓冲液入口，有A 、B、C、D 四根管路，方 便切换不同的缓冲液体系，默认使用A 管。中间为样品舱，可放置三种样品架：Reagent rack1、Reagent rack2、Sample and Reagent rack1 ，并能够进行4-45 度的温度控制，实验时 间较长时有利于保证样品的稳定性。右侧小瓶放有纯水，用于洗针，大瓶为废液出口。在 正面上部有状态面板，以指示灯显示仪器状态，状态面板下面即为芯片的放置位置，芯片 会与SPR 光学检测器、微流控系统IFC 嵌合，开展结合分析过程，T200 需选择S 系列芯片 型号，如下图所示。 二、实验准备 实验前需根据实验需求选择芯片，GE 提供羧基葡聚糖表面的CM 系列芯片、适用于 HIS 标签蛋白的 NTA 芯片、应用于生物素标记分子的 SA 芯片 （通常用于核酸、多肽）等， 蛋白研究最常用CM5 芯片，开展实验时会固定一个分子（配体）在芯片表面，另一个分 子（分析物）以流动相流过芯片，通过表面等离子共振SPR 的原理研究相互作用的过程。 根据实验目的，需要确定配体的偶联量，可通过以下公式进行计算，其中Rmax 代表芯 片的最大结合容量，为分析物在表面的最大响应值，Sm 为化学计量比，LigandMW 为配体 的分子量，AnalyteMW 为分析物的分子量，R 代表配体的偶联水平，也即需要求得的值， L 实际固定量一般设为1.5R 。动力学分析中，R 需低于100RU。 L max Biacore 对分子的互作检测是基于功能性的，所以实验过程必须要新鲜有活性的样品， 0.22um 膜过滤或者仔细离心，配体纯度要求在 90% 以上，分析物的纯度依实验类型而定， 进行动力学/亲和力分析时需要 90% 以上的纯度，进行浓度/特异性测定时可以进混合样品。 缓冲体系选择：大多数缓冲液均适用，可根据样品活性确定最适缓冲液，须新鲜配制， 经0.22um 膜过滤及脱气。氨基偶联方法固定配体时，缓冲液中不能含有Tris 、甘氨酸等 带有伯胺基的物质。分析物溶液中，不能含甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质，如果样品 中含有该物质，可通过缓冲液置换、透析的方法除去。 三、实验操作 在该部分中，选用CM5 芯片，以配体mouse-anti-human β2-microglobulin antibody 和分 析物human β2-microglobulin 的动力学分析为例进行操作介绍 （样品均来自Biacore getting started kit ），实验流程为配体固定-表面测试-再生条件筛选-分析物进样-芯片再生-数据分 析。 首先将缓冲液更换为实验所用缓冲液HBS-EP+，芯片更换为CM5 芯片，选择Tools- Insert chip，填入芯片信息，按照芯片表面箭头所指方向，将芯片放入并合上舱门，点击 dock chip 。选择Tools-eject rack，样品舱门会自动打开，放入样品架直至听到卡合声音， 点击OK 即可自动关闭舱门。缓冲液、芯片放置完毕，选择 Tools-prime 进行缓冲体系更换。 1、pH scouting ：在CM5 芯片上固定配体之前，需要筛选合适的配体缓冲液pH，使 配体通过静电吸附的作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果，通常会从pH5.5， 5.0，4.5 ，4 的10mM 醋酸钠中筛选，一般配体浓度为10-100ug/ml，初次实验可尝试 20ug/ml 。选择Run-wizard，surface preparation-immobilization pH scouting，单击New，可 设置过程参数。首先选择芯片通道，可从 1,2,3,4 通道任选一个，buffer 已经预置四种条件， 10mM 醋酸钠，pH5.5 , 5.0 , 4.5, 4，单击Next，输入配体名称mouse-anti-human β2- microglobulin antibody，contact time 180s，流速5ul/min，之后用50mM NaOH 再生