y13f定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（１２）：３６４１ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ Ｙ１３Ｆ定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性 １ １ ２ ２ ２ ３ 吴　芹 　胡　蝶 　李雪晴 　袁风娇 　李剑芳 　邬敏辰 （１江南大学生物工程学院　无锡　２１４１２２　２江南大学食品学院　无锡　２１４１２２　３江南大学无锡医学院　无锡　２１４１２２） 摘要　为改良米曲霉 （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）糖苷水解酶１１家族木聚糖酶ＡｏＸｙｎ１１Ａ的耐热性，将其 １３ Ｔｙｒ（Ｙ１３）置换为Ｐｈｅ（Ｆ）。基于ＡｏＸｙｎ１１Ａ与同一家族７种耐热木聚糖酶一级结构的多序列 Ｙ１３Ｆ 同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟，设计了一种突变酶ＡｏＸｙｎ１１Ａ ；以重组 质粒ｐＰＩＣ９ＫＡｏｘｙｎ１１Ａ为模板，采用ＰＣＲ技术将ＡｏＸｙｎ１１Ａ基因（Ａｏｘｙｎ１１Ａ）中编码Ｙ１３的密码 Ｙ１３Ｆ 子ＴＡＣ突变为 Ｆ的 ＴＴＣ，构建了一种突变酶基 因 （Ａｏｘｙｎ１１Ａ ）；分别将 Ａｏｘｙｎ１１Ａ和 Ｙ１３Ｆ Ａｏｘｙｎ１１Ａ 在毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５中实施了表达，并对重组表达产物ＡｏＸｙｎ１１Ａ和 Ｙ１３Ｆ ＡｏＸｙｎ１１Ａ 的耐热性进行了分析。结果表明：突变酶的最适温度 Ｔ 由突变前的５０℃提高到 ｏｐｔ Ｙ１３Ｆ ５０ ５０ ５５℃；ＡｏＸｙｎ１１Ａ 在５０℃的半衰期ｔ 为９５ｍｉｎ，较ＡｏＸｙｎ１１Ａ（ｔ ＝６ｍｉｎ）延长了约１５ １／２ １／２ 倍。由此经Ｙ１３Ｆ定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。 关键词　定点突变　木聚糖酶耐热性　Ｎ端区域　疏水相互作用 中图分类号　Ｑ９３６ 　　内切 １，４Ｄ木聚糖酶通常简称为木聚糖酶 中温木聚糖酶Ｘｙｌ１中引入额外的芳香族氨基酸疏水相 β （ｘｙｌａｎａｓｅｓ，ＥＣ３．２．１．８），是木聚糖降解酶系中的关键 １１ １６ 互作用ＴｙｒＴｙｒ，突变酶的熔解温度 Ｔ 较Ｘｙｌ１提高 ｍ 组分。基于酶蛋白一级结构的同源比对和疏水簇分 了９℃。 析，绝大多数木聚糖酶归属于糖苷水解酶家族 （ＧＨＦ） 　　作者所在实验室前期从Ａ．ｏｒｙｚａｅＣＩＣＣ４０１８６基因 ［１］ １０和１１ 。目前野生型或商品化的木聚糖酶多数为 组中克隆了一种ＧＨＦ１１木聚糖酶基因Ａｏｘｙｎ１１Ａ，并成 最适温度Ｔ 在４０～５０℃的中温酶，然而酶在使用过程 功将其在Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中进行了表达。除耐热性较差外， ｏｐｔ 中 （如纸浆漂白和饲料制粒等）经常会遭遇或需要高 ＡｏＸｙｎ１１Ａ是一种具有催化活性高、酶学特性优