牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１２）：２０２４ 牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达 及其单克隆抗体的制备 马　磊　朱远茂　蔡　红　王　姝　史鸿飞　吕　闯　董秀梅　高欲燃　薛　飞 （中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室　哈尔滨　１５０００１） 摘要　利用牛呼吸道合胞体病毒（ＢＲＳＶ）接种牛肺细胞（ＢＬ），提取病毒ＲＮＡ。通过 ＲＴＰＣＲ扩增 ＢＲＳＶ的核蛋白基因，然后定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ，获得重组表达质粒ｐＥＴ３０ａＮ。将重组 质粒转化表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经增菌培养和ＩＰＴＧ诱导以及ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，成功表 达出了核蛋白（Ｎ），其分子量约为４９ｋＤａ。为制备ＢＲＳＶ核蛋白的单克隆抗体，用纯化的重组核蛋白 免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与 ＳＰ２／０细胞融合。采用以ＢＲＳＶ为检测抗原的间接ＥＬＩＳＡ筛 选阳性细胞克隆，经３次克隆纯化后获得２株稳定分泌抗Ｎ特异性ＭＡｂ的杂交瘤细胞株，分别命名 为２Ｄ１２与４Ｂ１０。用２Ｄ１２与４Ｂ１０杂交瘤细胞株接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备腹水，采用ｒＮ及ＢＲＳＶ包被 ５ ６ ２ ３ 的ＥＬＩＳＡ测得的效价分别是１×１０和１×１０及１×１０和１×１０。间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＩＦＡ试 验表明两株杂交瘤细胞所分泌的ＭＡｂ具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定Ｄ１２与４Ｂ１０ 均为ＩｇＧ１／。特异性试验表明单抗２Ｄ１２与４Ｂ１０均不与牛副流感病毒３型和牛病毒性腹泻病毒反 κ 应。所制备的Ｄ１２与４Ｂ１０可用于建立检测ＢＲＳＶ病原及抗体的诊断方法。 关键词　牛呼吸道合胞体病毒　核蛋白　单克隆抗体　特异性 中图分类号　Ｑ８１９ 　　牛呼吸道合胞体病毒（ｂｏｖｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ 核蛋白（Ｎ）、磷酸化蛋白（Ｐ）与依赖 ＲＮＡ的聚合酶 ｖｉｒｕｓ，ＢＲＳＶ）属于副粘病毒科肺病毒属，为单股负链不 （Ｌ）。除此 之 外，还 有 基 质 蛋 白 Ｍ２。核 蛋 白 分节段的ＲＮＡ病毒，是牛呼吸道疾病的主要病原之 （ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎ）在病毒和感染细胞中大量存在，而且 ［１］ ［２］ 一 。１９６９年，该病毒首次分离于瑞士 ，此后在许多 在进化上非常保守。 国家和地区相继分离到该病毒。我国于２００８年在山 　　欧盟许多国家已将 ＢＲＳＶ感染列为仅次于牛病毒 东省采集的牛鼻腔棉拭子中检测到了ＢＲＳＶ，首次证实 性腹泻（ＢＶＤ）及牛传染性鼻气管炎（ＩＢＲ）的三大重要 ［３］ 了该病原在我国的存在 。犊牛以及青年牛感染 牛病之一。我国目前对该病尚未进行深入的研究，也 ＢＲＳＶ可导致肺炎、间质性肺水肿及肺气肿等。一般发 没有相关的商品化诊断试剂。本研究通过原核表达系 病率很高，可达５０％。 统成功表达了ＢＲＳＶ的核蛋白，用纯化的重组核蛋白免 　　ＢＲＳＶ病毒粒子具有多态性，多呈球形，直径３５～ 疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备了单克隆抗体（ＭＡｂ），对其反应 ［４］ １５０ｎｍ，或呈细丝状，长度可达到５ｍ 。ＢＲＳＶ基因 μ 性与特异性进行了鉴定，现将结果报告如下。 组全长１５４００ｂｐ，编码１１种蛋白质。病毒有一个囊膜， 包括糖蛋白、粘附蛋白和疏水蛋白。病毒核衣壳包括 １　材料和方法 收稿日期：２０１２０９０４　　修回日期：２０１２１１０１ １．１　病毒株、质粒和细菌株 哈尔滨市科技攻关计划（２０１０ＡＡ６ＡＮ０１９，２０１２ＡＡ６ＢＮ０２０）、公益