捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶 - 南京农业大学学报.pdf

摇 南京农业大学学报摇 2014,37(3):100-106 http:/ / 摇 Journal of NanjingAgricultural University doi:10.7685/ j.issn.1000-2030.2014.03.015 試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試 马春晓,张振超,李祥瑞,等.捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析[J].南京农业大学学报,2014,37(3):100-106 捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析 马春晓,张振超,李祥瑞,徐立新,宋小凯,严若峰* (南京农业大学动物医学院,江苏 南京210095) 摘要:根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计 1对特异性引物进行RT鄄PCR,将得到的片段克隆 到pMD19鄄T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET鄄32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/ AK 并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS鄄PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行 连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。 结果表明从捻转血矛线虫总RNA 中扩增出大小 约为1 104 bp 的DNA片段。 该基因与GenBank 中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。 SDS鄄PAGE 电泳结果表明该基 3 因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3伊10 ,主要以包涵体形式存在。 Western blot分析显示该重组蛋 白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。 重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30 益和 7.5。 结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。 关键词:捻转血矛线虫;精氨酸激酶;基因克隆;酶活性 + 中图分类号:S895.3 1摇 摇 摇 摇 文献标志码:A摇 摇 摇 摇 文章编号:1000-2030(2014)03-0100-07 Arginine kinase inHaemonchus contortus:cloning, expression and catalytic properties MA Chunxiao,ZHANGZhenchao,LI Xiangrui,XU Lixin,SONG Xiaokai,YAN Ruofeng* (College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing210095,China) Abstract:To obtain the arginine kinase gene(AK)from Haemonchus contortus,total RNA was extracted from the adult worms, followed by RT鄄PCR,using a pair of primers(P1:5忆鄄CGCGGATCCTTCACCATGTCTGTTCCTCCG鄄3忆/ P2:5忆鄄CCCAAGCTTCCCT鄄 TCAAGCCTTCTTCTCCA鄄3忆)targeting theAK geneofH.contortus.ThentheRT鄄PCRproductwaspurifiedandclonedintopMD19鄄T vector,and the recombinants were identified by PC