植物GSTZ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达.pdfVIP

第 41卷 第 1期 南 开 大 学 学 报(自然科学版) Vo1．41 N_O1 2008年2月 Aeta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis Feb．2008 文章编号：0465—7942(2008)01—0039—05 植物GSTZ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达 王维兰， 李 梅， 陈喜文， 黄晓燕， 贾向东， 陈德富 (南开大学 生命科学学院，天津 300071) 摘要：谷胱甘肽 一转移酶Zeta类(GSTZ)是一种重要的多功能酶，与细胞生化代谢、环境净化等密切相关． 将拟南芥、甘蓝型油菜“陕2B”和“垦C1”的GSTZ基因重组到表达载体pPIC9，电转化到毕赤酵母株GSll5中， 得到了分泌表达GSTZ酶的毕赤酵母工程菌株．甲醇诱导表达显示，最佳诱导时间在48～60 h，DCA—DC比活 力为83．21～115．31 U／rag，GSTZ分泌量为25．71～42．90 U／mL．研究结果表明，植物GSTZ基因在毕赤酵母 中的表达是高效的，为大规模发酵生产GSTZ奠定了基础． 关键词：谷胱甘肽S一转移酶 Zeta类 ；二氯乙酸脱氯(DCA—DC)括力 分泌表达；毕赤酵母 中圈分类号：Q75 文献标识码：A 0 引 言 谷胱甘肽 一转移酶(glutathione S—transferases，GSTs，EC．2．5．1．18)是一个超家族酶系，由两个亚 基组成，存在于所有真核生物中，具有多种生化功能，可以催化还原型谷胱甘肽(GSH)巯基与其它化合物 的亲电基团作用，使生物体内有害的毒性物质与谷胱甘肽相结合，生成谷胱甘肽衍生物，产生更容易溶解 且毒性降低的物质后以非酶形式排出体外n ]．植物中含有多种类型的GSTs，依据氨基酸序列的相似性， 植物GSTs酶系可分为Phi、Zeta、Tau和Theta四类[3]．Phi和Tau类仅存在于植物中，而Theta和Zeta 类不仅存在于植物中，动物和真菌中也存在． 谷胱甘肽 辱睾移酶 Zeta类(glutathione S—transferase zeta class，GSTZ)是一种重要的多功能酶． GSTZ具有顺丁烯二酰乙酰乙酸异构酶(MAAI，E．C．5．2．1)活性，MAAI是生物体内的苯丙氨酸、酪氨 酸代谢的关键酶，催化顺丁烯二酰乙酰乙酸盐异构为延胡索酰乙酰乙酸盐 ]．GSTZ对自来水氯处理过 程中产生的对啮齿动物具有致癌毒性的二氯乙酸(DcA)及其类似卤代物有较强的脱卤活性，在水净化方 面具有很高的应用价值 ]． 在克隆拟南芥和甘蓝型油菜“陕2B”和“垦C1”GSTZ基因的基础上，前文 分析了其在大肠杆菌、小 麦胚芽无细胞及酿酒酵母系统中的表达特性．由于大肠杆菌表达系统缺少糖基化修饰过程，小麦胚芽无细 胞蛋白合成系统的实验成本高、表达量低，酿酒酵母表达系统属于非整合非分泌型表达系统，因此不合适 或难以大规模地表达GSTZ．毕赤酵母系统为整合分泌型表达系统，表达高效且稳定，且具糖基化修饰特 性而使目的蛋白免受蛋白酶攻击的特点，是近年来极具潜力的真核表达系统．本文以毕赤酵母为表达系 统，分析了3种植物GSTZ基因表达特性，以期为大规模高效表达GSTZ研究奠定基础． 1 材料和方法 1．1 材料 1．1．1 菌株与质粒：大肠杆菌DH5a—FT和毕赤酵母GS115均为本室保存，分泌型毕赤酵母表达载体 pPIC9购自Invitrogen公司，GSTZ基因扩增模板为前文…构建的大肠杆菌重组质粒p21一At、p21一BnB和 收稿日期：2007—03—12 基金项目：国家自然科学基金 作者简介：王维兰(1976一)，女，山东青岛人，硕士． ·40· 南开大学学报(自然科学版) 第41卷 p21一BnC． 1．1．2 试剂与培养基：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、Ex Taq@DNA聚合酶及dNTPs等购自宝 生物工程(大连)有限公司，引物由宝生物工程Ck连)有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯．培养基 LB、YPD、MD、