近代仪器分析教学课件-第二章 高效液相色谱.pptVIP

　　高效液相色谱法是本世纪60年代末期，在经典柱色谱法基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，和引入气相色谱理论而发展起来的分离技术。 泵压：6000 psi (42MPa) 流速：1－10ml/min 固定相粒度：1.5－10μm 柱效：104－105 塔板数／m 　　　检测器：紫外检测最小检出量达10-12g，荧光达10-13g。 现已成为色谱法中应用最广的一类方法，用于高沸点，高极性，难挥发和热不稳定的化合物，离子型化合物、高分子及生物大分子的分析。 HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相、输液设备和检测手段之间的差别 高效液相色谱与气相色谱比较 二、高效液相色谱法的类型 1. 吸附色谱 2. 分配色谱 分配机理分离实例 ODS,苯基和氰基柱的不同选择性比较 CN-3 和 ODS 柱的比较 CN柱正相（NP）和反相（RP）分离模式的比较 ODS柱分离多环芳烃 应用：离子型化合物，氨基酸，蛋白质，核酸。 　　　离子色谱是在离子交换色谱基础上发展起来的。由于离子交换色谱法没有与之相匹配的检测器，难以发挥更大作用，1975年Small将电导检测器用于离子交换色谱采用“抑制柱”消除了洗脱液中离子的干扰，成功的分离了无机离子和大多数有机离子。称之为“离子色谱”，成为分析无机和有机离子十分重要方法，在环境科学、生命科学、食品科学等领域获得广泛应用。 离子色谱类型：1. 双柱离子色谱（有抑制柱） 2. 单柱离子色谱 抑制柱：阳离子分离柱填充强碱性（OH－）阴离子交换树脂。 阴离子分离柱填充强酸性（H＋）阳离子交换树脂。 即抑制柱填充了电荷与分离柱相反的离子交换树脂。 作用：（1）使流动相变成低电导组分，以降低检测背景。 　　 （2）将样品离子转变成相应的酸和碱增加电导响应。 应用：离子色谱已有多种分离方式和多种检测手段，成为无机阴、阳离子和有机离子的分析中重要而灵敏的方法。 A.生物大分子物质的分离纯化 B.分子量的测定（从小分子直至分子量达 106以上的高分子） C.分级分离 D.溶液浓缩 E.平衡常数的测定 F.细胞及颗粒的分离 凝胶过滤适用于多肽、蛋白、生物酶和糖的分析。凝胶渗透适用于高聚物分子量测定。 5. 亲和色谱 固定相：由基质（载体），伸长臂和具有特殊 亲和力的配体组成。 三、分离模式的选择 Type of HPLC Depends on: Molecular weight of solute Water solubility of the solute Polarity of the solute Ionic/non-ionic character of the solute 五、液相色谱仪 高效液相色谱仪流程图 4.液相色谱检测器 液相色谱检测器类型 选择性检测器： （1）紫外－可见（Ultraviolet detector, UV） 可变波长（Variable wavelength） 二级管阵列（Diode Array Detector， DAD） （2）荧光（Fluorescence detector） （3）电化学（Electrochemical detector） （4〕质量检测器（ Mass Detector, MSD） 蒸发光散射检测器的特点： 1.可作梯度 2.流动相可为 100% 的水和可挥发的缓冲液 3.对温度不敏感 4.灵敏度高10-50ng 5. 通用型质量检测器，对各种物质均有响应，且响应因子基本一致,它不依赖样品分子中的特殊官能团或生色团。 质量检测器 结构： 1. 电喷雾离子化（ESI）和大气压 化学离子化（APCI）的MS。 2. 化学工作站。 功能： 1.快速鉴定化合物 2.色谱峰的纯度检验 3.复杂基质中痕量成分定量 液相色谱的检测器性能对比 1.生物及生物工程 2. 药物 3.食品分析 　　　　 4.环境分析 农残 酸类 5.精细化工 通用型检测器： （1）示差折光(Refractive index detector, RI) （2）蒸发光散射（Evaporative light-scattering detector, ELSD） 1. 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数），除紫外检测器之外应用最多的检测器； 2. 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 3. 灵敏度低； 4. 对温度敏感； 5. 不能用于梯度洗脱； 示差折光检测器分为：偏转式、反射式和干涉型 示差折光检测器的特点（diff