存活率=重新生长细胞.PPTVIP

第九章 种质保存;种质资源保存的一般概念;第一节 种质资源保存的一般概念;一、概念;二、种质保存的方式;珍宝岛国家级自然保护区;2.异地保存 是将种子、植物体保存于该植物原产地以外的地方，异地保存则通过建立植物园、种质资源圃、种子库以及离体保存等方法来实现。 种质资源的离体保存：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。;华南植物园 ;;第二节 低温保存;一、低温保存的概念;2.基本特征 保存材料的定期继代培养，不断繁殖更新。 3.材料的选择 保存过程中要选用遗传上稳定的外植体作为起始培养材料。 具有器官分化能力的体细胞胚； 茎尖分生组织。;二、低温保存的方法;3.改变培养基成分 （1）培养基中添加生长调节物质 添加生长延缓剂或生长抑制剂来抑制保存材料的生长，延长其继代周期。 （2）提高培养基渗透压 （3）培养基的营养控制 ;第三节 超低温保存;一、概述;2.特点 （1）超低温保存技术可极大地延长储存材料的寿命； （2）避免细胞和组织因长期继代而发生的变异； （3）避免了离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害； （4）可有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。;3.适宜的材料 在超低温保存中茎尖和幼胚等较为合适。这些材料遗传稳定，再生能力强，解冻后易于成活和种植，对于冷冻和解冻过程中所产生的胁迫忍受能力也强。;二、冷冻的方法;（二）慢速冷冻法 以每分钟0.1～10℃的降温速度使材料从0℃降 至-10℃左右，随即浸入液氮，或者降至-196℃。在此条件下可以使细胞内的水有充足的时间不断地转移到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少到最低限度，避免在细胞内结冰。 适宜材料：本法适用于成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。;（三）分步冷冻法 1．两步冷冻法 此法实际是慢速冷冻法和快速冷冻法的结合。它的第一步是采用0.5-4℃/min的慢速降温使温度从0℃降至-40℃；第二步是投入液氮迅速冷冻。植物材料在第一步冷冻后???必须停留一段时间，使材料充分脱水。 适宜材料：悬浮培养细胞和愈伤组织的冷冻保存多使用此法。;2．逐级冷冻法 此法是在程序降温仪或连续降温冷冻设备的条件下采用的一种冷冻保存方法。一般先制备不同等级温度的溶液。如-10℃、-15℃、-23℃、 -35℃、-40℃等。植物材料经冷冻保护剂在0℃处理后，逐级通过这些温度。在每一级别温度中停留一定时间（4-6min）然后浸入液氮。这种方法使细胞在解冻后呈现较高的活力。;（四）干燥冷冻法 此法是将植物材料置于27～29℃烘箱内，使其含水量由72-77%降至27-40%后，提高其抗冻性，再浸入液氮，可以使植物材料免遭冻死。;三、提高冷冻后细胞或组织存活率的方法;（二）冷冻前的预处理 总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。 1．悬浮培养或继代培养 采用饥饿法使细胞分裂处于同步。能提高在液态氮保存后的存活率。;2.预培养 冷冻前对材料进行短暂培养可以提高冷冻处理后的存活率。将细胞适度脱水，也可提高存活率。 3．低温锻炼 将植物茎尖在冷冻之前，放在4℃下处理3天。可提高存活率。;4．冷冻防护剂 降低冰点，促进过冷却和玻璃态化的形成； 提高溶液的黏滞性，阻止冰晶形成； DMSO可以使膜物质分子重新分布，增加细胞膜的透性，在温度降低时，加速细胞内的水流往细胞外结冰； 稳定细胞内的大分子正常结构，特别是膜结构，阻止低温对膜的伤害。 DMSO、甘油、糖、糖醇类。;（三）解冻方法 解冻是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一步恢复培养。 解冻的速度慢，细胞内容易发生再结晶，导致细胞死亡；速度快，再结晶的过程来不及发生，细胞存活率高。 解冻可分为快速解冻和慢速解冻两种方法。;（1）快速解冻法 把冷冻的材料取出后，迅速放入35～40℃(该温度下解冻速度一般为500～700℃／min)温水浴中解冻，并小心摇动，待材料中的冰晶完全融化为止。由于此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻，为多数研究者采用。;（2）慢速解冻法 慢速解冻法是把材料置于0℃或2～3℃的低温下慢慢融化。少数超低温保存的材料只有采用慢速解冻才能存活，如木本植物的冬眠芽，因其在慢速冷冻的过程中，经受了一个低温锻炼过程，细胞内的水分已最大限度地渗透到细胞外，若解冻速度太快，细胞吸水过猛，细胞膜就会受到强烈的渗透冲击而破裂，进而导致材料死亡。 因此，解冻速度的选择应参考冷冻速度。;（四）重新培养 清洗冷冻防护剂 加入特殊物质（植物激素、活性炭）;四、冷冻保存后细胞和器官活力的检测;本章小结;Thank Y