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荧光定量PCR研究进展 生物工程 赵丰辉 2111505157 摘要：荧光定量PCR ( Fluorescence in Quantitative PCR, FQ-PCR)技术是20世纪90年代发展起来的一种新的核酸定量技术，具有高准确性、高特异性等特点，在生物科学以及生物医学方面的研究中有着极为重要的作用。本文对荧光定量PCR技术进行介绍。 关键词：荧光定量PCR；qPCR技术；探针 荧光定量PCR是美国PE(Perkin Elmer)公司于1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术与普通PCR相比，该技术利用荧光标记来实现其定量功能，它汇聚了PCR技术高效扩增核酸、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性及高精确性等优点，直接获取PCR过程中的荧光信号，从而获取定量结果[1-3]。与常规PCR相比，该技术具有操作简便、快捷、高效又能定量获取PCR等优点。该技术是在封闭的体系中完成扩增，消除了交叉污染，并且结果无需凝胶电泳，只需通过探头检测便可获取结果，定量结果准确，因此，该技术在许多科研领域中有着更广泛的应用。 1 荧光定量PCR原理 荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模版进行定量分析。在传统的PCR中，反应过程经过循环数的增加，扩增产生DNA，最后利用凝胶电泳来检测反应的最终产物。而荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，荧光信号随着反应的进行而逐渐增强，在设备的实时监测下，分析荧光信号的累计。随着反应的进行，荧光信号的变化可以绘制成一条曲线，即为标准曲线[3]。当扩增循环进入指数期后，检测PCR产物的量，据此可推算模版最初的含量[4]。在PCR反应的指数期设定一个可检测荧光信号的阈值，扩增样本荧光信号达到阈值所需要的循环数为Ct值。有研究表明[5]，模板Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的样品做出标准曲线，即可根据样品Ct值算出样品的其实模板量。 2 荧光定量方法 2.1 非特异性DNA结合染料法 该法所用染料具有与DNA特异性结合的特点，当染料与DNA双链结合时，在光源的照射下发出荧光。随着PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也逐渐增大，两者结合后被激发出荧光信号，而不掺入链中的染料则不会被激发出任何荧光信号。通过对已知拷贝数的阳性模板做成荧光定量PCR标准曲线，再将未知样品与标准曲线比较，即可得出定性和定量的结果。在该反应体系中，荧光信号的强弱即代表了双链DNA分子的量。由于该染料与DNA双链结合的非特异性，它可以和反应体系中的所有DNA分子结合，因此，该法易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响，从而使定量结果不可靠，因此该法的特异性不如探针法。但是，该法可以根据融解曲线分析特异性和非特异性扩增，引物的设计和反应条件的优化对获得较好结果有很大帮助[6]。 2.2 探针法 在荧光定量PCR中，除去普通PCR的两条引物之外，加入1条或者2条荧光标记的基因探针。探针5’端标记荧光报告基因(R)，3’端标记荧光抑制基团(Q)。在该探针保持完整之时，Q基因便会抑制R基因的荧光信号。PCR反应开始后，随着链的不断延伸，Taq酶移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5’-3’外切酶活性，将荧光探针切断并释放出R基因的荧光信号。R基因荧光信号的强弱与PCR产物数量成正比，反应结束后，由电脑自动算出DNA的拷贝数[7]。 2.2.1 Taqman探针法 该法使用DNA聚合酶，探针在5’端标记荧光报告基因，在3’端标记淬灭荧光基因，探针在完整时报告荧光基团发出的荧光被淬灭荧光基团吸收，因此没有荧光产生。在延伸阶段，由于DNA聚合酶的5’-3’端外切酶活性，5’端标记报告荧光基团被水解，远离淬灭荧光基团，于是产生荧光信号。当正确的底物扩增出来后，探针就会在复性阶段与其杂交，当聚合酶延伸到探针时，它就会将探针的5’端替换，并将报告基团切除，这就使得报告基团与淬灭分子分开，从而使荧光信号释放[8]。 2.2.2 Amplisensor Amplisensor是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接淬灭物。两个探针的长度不同，其中淬灭物标记探针5’端多出7个碱基。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针，引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET.而产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比[6]。 2.2.3 分子信标法 分子信标是一种能与DNA杂交的探针，是一种具有茎-环结构的探针，环状部分与靶序列互补，而两个臂的序列存在部分互补。它有三个特点：一是