第一链cDNA合成试剂盒.PDF

第一链 cDNA 合成试剂盒 First-Strand cDNA Synthesis Kit （反转录试剂盒） 一、试剂盒组成： Material Provided ZK402 (50 次) 2X First-Strand Buffer 500 μl RT-mix 50 μl Random primer (0.1μg/μl) 50 μl Oligo(dT)18 primer (0.1μg/μl) 50 μl DEPC-treated Water 1ml Protocol 1 份 注意：所有试剂必须在-20℃保存。 二、简介： 本试剂盒提供的试剂能从微量的 poly(A)+ mRNA 或总 RNA 中高效率的合成出 cDNA 第一链。MMLV Reverse Transcriptase 是已知反转录酶中 RNA 反转录活性最强的一种。它能 非常有效地以 RNA 为模板，在 Oligo(dT) primer, Random Primers 或其它特定的引物与 RNA 退火后，从引物的 3’-末端合成与 RNA 互补的 DNA （cDNA 第一链）。第一链cDNA 可以用 于后续的荧光定量 PCR(与荧光定量 PCR 核心试剂盒配合使用) 、RT-PCR 、cDNA 库构建等 实验。 三、准备工作： 1）用0.1%DEPC 水过夜室温或 37C 处理 1.5 ml Eppendorf 管和取液用 10μl, 200μl 和 1 ml Tip, 高温蒸气灭菌，80℃烘干备用。 2 ）制备RNA模板。总RNA和mRNA均可以作为First-Strand cDNA合成的模板材料。本 试剂盒每次反应需要 500ng-2μg左右 总RNA或者 25-50ng左右的mRNA 。RNA溶于 DEPC －H2O，体积小于 8μl 。 四、First-Strand cDNA 合成： 注意：戴手套进行以下操作，严防 RNase 污染。 １．在1.5ml Eppendorf管中加入 500ng-2μg 总RNA, 或 25-50ng poly(A)+ mRNA 。加入 DEPC －H2O使总体积为 8μl 。 ２．加入1μl Random primers，或 1μl Oligo(dT)18 primer ，或者 1ul的特异性下游引物 (25pmol/ul) 。小心混匀。 ３．65℃保温５分钟。 ４．室温放置10 分钟。室温高速离心 5 秒钟，将所有溶液收集到管底。 ５．按次序分别加入下列试剂： 2X First-Strand Buffer 10ul RT-mix 1ul Total: 20ul ６．小心混匀，如果是用Random primers ，建议25 ℃10 分钟，40 ℃50 分钟；如果是用 Oligo(dT)18 primer ，建议42 ℃50 分钟；如果是用特异性的下游引物，建议 48 ℃50 分钟。 ７．然后90℃处理５分钟。冰上冷却，室温高速离心 5 秒钟，将所有溶液收集到管底。 ８．反转录好的cDNA可以用于PCR扩增、荧光定量PCR检测或cDNA 的2nd链的合成。 五、注意： + 引物如何选用取决RNA模板的类型。Oligo(dT)18引物用于RNA 3’-末端有poly(A) 结 构的cDNA合成，合成效率高，特异性好。Random primer则适用各种RNA,合成效 率高，通用性好，但特异性较差，对RNA模板的质量要求较高，通常要求RNA模 板无D