总RNA提取和逆转录.pptVIP

分子生物学实验;;1. 加样器 2. 离心机 ;3、 根据取样量，选择合适量程的加样器。;练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?; 5、加样器使用步骤： 1）选择加样器,观察读数,调节读数。 安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。 2）在液面外，先按到第一挡。 3）将吸头插入液面下的适当深度: 过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。 4）缓慢松开拇指,吸取液体。 完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。 5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去 6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！) 7) 观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。; 1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。; ; 一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt;二、RNA提取的注意事项 ;1) 发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。 将1mL Trizol试剂移入Eppendorf管中。 2) 实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3) 将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。;1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下???以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。;RNase抑制剂介绍;5)加入200 ?l氯仿， 　 震荡混匀20-30s， 　　室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。 ６)10000 rpm，离心5min。;8) 沉淀RNA： 加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。 10000rpm，离心10min。弃上清。 ９) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀) 10) 7500rpm离心1min，弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。;12)室温干燥3－5min。 （干燥的时间由RNA沉淀大小决定） （干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）;13） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5?l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 14) 吸出 4.5 ?l溶液放到冰上备用　(将用于电泳)。 15) 剩余 9 ?l溶液放到冰上备用 （将用于RT－PCR）。;逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNA－cDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。;第一步：　打开RNA链之间的二级结构， 　　　　　使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。 总