自身肺癌抗原致敏DCs抗肺癌体外免疫效应探究.docVIP

自身肺癌抗原致敏DCs抗肺癌体外免疫效应探究【摘要】 目的 探讨自身肺癌抗原致敏树突状细胞(Dendritic Cell,DC)的体外免疫效应。方法 体外原代培养肺癌细胞,并制备冻融抗原,冲击DCs,致敏肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和外周血T淋巴细胞,MTT法检测DCs瘤苗体外联合抗肺腺癌细胞效应。结果 采用效靶比为30:1和20:1的比例,30:1和20:1的CTL杀伤率为(18.21±2.89)和(24.69±3.51); 30:1和20:1的CTIL杀伤率为(25.46±3.02)和(27.52±2.68),CTIL比CTL杀伤率高(P 1.2.3 肺癌自身抗原致敏DCs DCs培养第3天换液时加入肺癌自身抗原100μl/孔,第6天每孔加入LPS(5 mg/L),第7天收获成熟DCs。取肺癌自身抗原致敏的成熟DCs(DC瘤苗)与T淋巴细胞和TIL以1∶20比例混合,共培养3 d。DCs递呈抗原并激活幼稚T淋巴细胞,促使T淋巴细胞活化为细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)和肿瘤浸润性淋巴细胞(CTIL)。 1.2.4 MTT法检测DCs瘤苗体外联合抗肺腺癌细胞效应 1.2.4.1 肺腺癌细胞的培养 将人肺腺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的RPM11640培养液中,37℃,5%CO?2培养箱培养,每3~4 d传代一次。 1.2.4.2. DCs诱导肺癌特异性CTL 致敏的T细胞(CTL和CTIL)为效应细胞,按效靶比分组,A组:靶细胞对照组(A549细胞);B组:效应对照组(未致敏的T淋巴细胞+ A549细胞);C组:效应对照组(未致敏的TIL细胞+ A549细胞);D1组:肺癌特异性CTL+ A549细胞(效:靶=30:1);D2组;肺癌特异性CTL+ A549细胞(效:靶=20:1);E1组:肺癌特异性CTIL+ A549细胞(效:靶=30:1);E2组:肺癌特异性CTIL+ A549细胞(效:靶=20:1)。将以上细胞接种于96孔板,每组复种8孔,并且重复3次。培养72 h,最后4 h加入MTT20μl(5 mg/ml)。培养4 h后1000 rpm离心5 min弃上清,补入150 μl二甲基亚枫(DMSO),1充分震荡0 min后用酶联免疫检测仪在波长570 nm检测OD值。以下公式计算杀伤活性:CTL杀伤活性=[(效应对照组OD值一实验组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100%。并比较实验组间对肺癌细胞的杀伤效果。 1.2.5 统计学方法 本实验统学计分析均采用SPSS 11.0统计软件。所有数据用表示,采用单因素方差分析,以a=0.05为检验水准。 2 结果 2.1 DCs的体外培养 外周血分离获得单个核细胞(MNCs),贴壁2 h后吸出悬浮淋巴细胞,获得贴壁良好的小而圆的单核细胞(Mo),加入GM CSF和IL 4,细胞培养24 h后均可见贴壁的Mo聚集成均匀散布的细胞聚体(粒 巨噬细胞集落形成单位,GM CPU)。3 d后可见部分细胞有突起伸出,5 d后大量突起交织在一起。培养7 d后,大量树突状形态细胞从贴壁、半悬浮状态变为悬浮状态,细胞变大变圆,均匀散布于培养基中,为典型DCs形态(图1)。 图1 倒置显微镜下原代培养的DCs ×200 A培养第3天 B培养第5天 2.2 DCs瘤苗体外联合抗肺腺癌细胞效应与对照组相比,采用效靶比为30:1和20:1的比例,结果肿瘤浸润淋巴细胞TIL比外周血T淋巴细胞杀伤活性强(P 1