胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。.PDFVIP

逆转录病毒载体属RNA 病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA 互补链，此DNA 单链 可作为模板合成第二条DNA 链，第二条DNA 链可掺入细胞基因组DNA 中。此病毒可利用宿 主细胞的酶自行转录与复制，RNA 可合成蛋白，再包装病毒，RNA 从胞内释放，成为感染性病 毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。 首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还 具有适当的结构。如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、 CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol 和env 蛋白才能使带有包装信号 及目的基因的病毒载体RNA 进行包装，包装细胞只提供gag、pol 和env 蛋白而不产生具有复 制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生 RCR，安全性较差；第二代包装细胞， 临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细 胞中主要区别是病毒结构基因中env 不同。 反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：①反转录病毒感染细胞的效率高，基因转移 率在10%-100%；②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在 而不丢失；③外源基因整合的拷贝数一般只有一个；④反转录病毒只选择感染分裂细胞；⑤病 毒可容纳外源基因的DNA 长度为8Kb。 反转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol 和env，包括两侧的 LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。 (一)可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立 1、逆转录病毒载体进入包装细胞系 从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生 细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产 生细胞。 1.1 准备工作（用品）： (1)适当的包装细胞系及培养液 (2)大多数包装细胞系为鼠源的，含有鼠“Helpe 病毒”，此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的 逆转录病毒复制，并包装于蛋白衣壳中。 (3)逆转录病毒质粒DNA 常构建成含有抗药基因neo 新霉素基因的载体。 (4)Hepes-缓冲液(HeBs) (5)2mol/L CaCL2 (6)含血清及不含血清培养液 (7)HeBs 15%甘油（HeBs/甘油） (8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素对抗物) (9)10%～15%DMSO (10)10cm、6cm 培养皿 (11)24 孔、6 孔培养板 (12)克隆环 赫贝公司总部地址: 杭州市文一西路 1378 号杭州师范大学科技园F 楼7 层 电话：0571；传真：0571 南京分公司地址：南京市鼓楼区童家巷24 号中国药科大学 ；025-mail ：sale@ 网址： 1.2 操作步骤： (1)转染前，10cm 培养皿中接种大约10%～20%皿底面积的包装细胞。 (2)将10μg 含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA 加入0.5mL HeBs 中，加入32μL 2mol/L CaCL , 2 轻振动，加盖30 分钟，室温下培养45 分钟，直到小的、模糊的兰色沉淀产生。 (3)从包装细胞中弃去旧液，轻轻滴入HeBs-DNA 沉淀于细胞培养皿中心，使细胞接触DNA20 分钟，每10 分钟轻轻摇动培养皿，使溶液均匀，加入10mL 培养液，并于37℃放置4 小时。 (4)完全吸出培养液，逐滴加入2.5mL 的HeBs/甘油，放回培养箱继续培养，如果使用的是 ψ2/YCRE/YCRIP/PA317 包装细胞系，需培养3.5 分钟，若为Q2bn 包装细胞系，需培养1.5 分钟，或根据不同包装细胞选用不同时间。迅速弃去HeBs/甘油，用10mL 培养液洗2 次，加 入含有血清的5ml 培养液培养18～24 小时。 (5)取出培养液用0.45μm 过滤，可获得含有短期产生病毒的培养