此外还有体外转录长双链RNA,模拟自然状.PDFVIP

4. siRNA 的制备合成 法，设计完 siRNAs 后，选择值得信赖的 RNA 设计完了，就到合成制备 siRNA 了。要 合成厂家，订单发出把钱付掉，就可以等着收 得到小分子双链 RNA ，除了简单方便的化学 货了。对于普通培养细胞来说，siRNAs 比质 合成，也可以用体外转录合成小分子 RNA ， 粒更容易转染进入细胞。 此外还有体外转录长双链 RNA ，模拟自然状 体外转录合成 siRNA合成 DNA 态下 siRNA 生成过程用 Dicer 酶或者 Oligo 比RNA 要便宜太多了。用合成的 DNA RNAseIII 切割为 siRNAs 碎片这个方法不 模板做体外转录。操作上有点麻烦。 需要设计具体的 siRNAs，由于得到的是 体外转录+Dicer 酶或则会 RNAseIII siRNAs 混合物，基因沉默成功率比单一的 切无需精确设计 siRNA，基因沉默成功几 siRNA 要高。不过还是要按照一定的规则如 率相对高，节约时间和费用。 避开与其他基因同源区域等原则选择体外转 质粒/病毒载体表达 shRNAs让载 录的片段。用载体表达 shRNA(前面提到的线 体进入细胞后表达 shRNA，在细胞内加工为 路 3)，我们留到后面讨论。 siRNA，可实现其他方法无可比拟的长时间基 因沉默效果（2 周以上），载体可循环、长期 4.1 siRNA 4 种制备方法之比较： 使用 ，但是需要大量克隆的苦力工作。 化学合成化学合成是最常用的方 4 种 siRNAs 合成方法各有所长。如何选择合适自己实验需求的 siRNAs 合成方法？生物通小编在这 里为你列表说明，我喜欢表格的简单，清晰，明确，虽然我写文章比较的罗嗦。 siRNA 制备法 化学合成 体外转录合成 siRNA 体外转录+Dicer 酶切 质粒/病毒载体表达 shRNA 1.设计/制备目标长链 DNA 模 1. 自行设计siRNAs 1. 自行设计长 板（200-800bp ，一端或两端带 1.设计 55-60mer 短发夹结构 shRNA 2.订购 DNA Oligos 引物 20-25bp 的 siRNAs 启动子） 2.定制合成 DNA Oligos 引物 siRNA 制备流 3.体外转录/退火 2.选择可信赖的合 2.体外转录/退火 3.DNA 产物克隆到载体中 程 5.DNAse 和单链特异的 RNAse 成厂家，定制合成 3.Dicer 酶/RNaseIII 消化为 4.分离鉴定转化子，测序 消化未匹配的单链 RNA ，DNA siRNAs siRNAs 小片段混合物 5.重组质粒扩增 6.过柱纯化 4.过柱纯化 荧光标记 可荧光标记 siRNA 可用荧光标记 siRNA 可用荧光标记 siRNA 不可标记 siRNAs 基因沉默时效 3-7 天短暂 3-7 天短暂