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蛋白穿越重现之旅 ——Western Blot技术 北京全式金生物技术有限公司 Western Blot 的起源和应用及原理 Western Blot实验流程详解 Western Blot实验中的常见问题分析 • Western Blot 蛋白质印迹法 • 又称免疫印迹试验，它是分子生物学、生物化 学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 • 基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过 的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着 色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析 的细胞或组织中表达情况的信息。 Western Blot起源 • Renart, J., J. Reiser, G. R. Stark, (1979). Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A 76(7): 3116-20. • DNA杂交技术，Southern Blot 1975 • RNA杂交技术，Northern Blot 1977 • 蛋白质印迹技术，Western Blot 1979 Western Blot 的应用 • 定性或半定量分析目的蛋白的特异性表达 • 蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作 用的后续分析 • 蛋白修饰的鉴定（磷酸化、糖基化的鉴定） Western Blot实验原理 • 直接法 • 间接法 Western Blot 的起源和应用及原理 Western Blot实验流程详解 Western Blot实验中的常见问题分析 Western Blot实验流程 样品制备及定量 SDS转膜 显色发光 抗体杂交 封闭 样品制备 SDS 及定量 电泳 转膜 显色 抗体杂交 封闭 样品制备 • 总体原则 – 整个提取过程在低温下进行，保持蛋白处于溶 解状态，防止蛋白变性、降解与修饰。 – 根据实验目的选取不同抽提液和抽提方法。 有时需要去除体系中的核酸、无关蛋白等干扰成分 – 方法简便，耗时短，易于操作。 – 制备好的样品若不立即使用，需分装冻存于- 80℃冰箱，及防止储存过程中降解。 样品制备方法简介 • 培养细胞的裂解 • 组织细胞的裂解 弃细胞培养基 冰上分离目的组织 1 ×PBS洗涤 液氮研磨 加入细胞裂解液 加入细胞裂解液 冰上裂解细胞 冰上裂解组织细胞 离心收集上清 离心收集上清 细胞裂解液 组分 作用