09-PCR技术及其应用.pdf

专题9 PCR技术及其应用 oPCR技术原理和工作方式 oPCR产物的克隆 oPCR扩增未知DNA片段 o与反转录相关的PCR oPCR产生DNA指纹 o实时定量PCR PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 9.1 PCR技术原理和工作方式 9.1.1 PCR的基本原理 ⒈基本要素和扩增原理 o 待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链 DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。在PCR扩增中 一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA聚合酶在dNTP等 底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA 链。 o 图9-1是PCR扩增前4轮产物的增长过程，每一轮包括3个 步骤（变性、退火和延伸），从中可以看出PCR的整个 扩增进程。 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 图9-1 PCR扩增反应原理图 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ⒉ PCR扩增的步骤 o 变性（denaturation）：将模板DNA置于92-96℃，使 dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学 性质 o 退火（annealing）：将温度降至37-72℃，使引物与模 板的互补区相结合 o 延伸（extension）：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP 连续加到引物的3 -OH端，合成DNA。 o 这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个 循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 9.1.2 PCR反应体系 ⒈缓冲液 o 标准的缓冲液含10 mM Tris·HCl，pH为8.3-9.0 （室 温），而在延伸温度 （72℃）下pH接近7.2。缓冲 2+ 2+ 液中含有Mg 或Mn ，用于激活DNA聚合酶的活性中 2+ 心。标准Mg 浓度为1.5 mM。 2+ o Mg 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率，直接 影响扩增的成败，因此要求作预备试验寻找最佳浓 度。 o 缓冲液中还含有50 mM的钾离子。有些缓冲液中还 加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C模板的扩增效率。 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ⒉脱氧三磷酸核苷 o 脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，标准的PCR反应体系 中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和 dGTP，终浓度一般为200 μM （即饱和浓度）。 o dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性（specificity） 和保真度 （fidelity）。 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ⒊ 引物 o 在多数试验中人们