NaCl胁迫对转IrrE基因烟草抗氧化酶活性影响.docVIP

NaCl胁迫对转IrrE基因烟草抗氧化酶活性影响摘要:文章主要研究了转IrrE基因烟草幼苗对NaCl胁迫的耐受性应答情况。结果表明,在200mmol/L NaCl胁迫下,其中野生型烟草随着胁迫时间的延长,POD、SOD、CAT三种抗氧化酶活性和可溶性蛋白的含量逐渐升高,处理24 h后达到一个峰值,然后又逐渐降低,叶片的相对含水量一直逐渐降低,而转IrrE基因烟草幼苗三种抗氧化酶活性和可溶性蛋白持续上升,相对含水量先有所降低然后逐渐升高,5个生理指标均高于野生型烟草。因此,IrrE基因作为一种转录因子可能调控了盐胁迫相关基因的表达,从而提高了植物对NaCl胁迫的耐受能力。 关键词:IrrE基因;抗氧化酶;烟草 中图分类号:S572 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)06-0063-2 土壤盐渍化问题可谓触目惊心,正肆无忌惮地吞噬着人类赖以生存的有限的土地资源,成为严重制约农业生产的一个全球性问题。植物耐盐的分子生物学和植物耐盐基因工程在提高农作物耐盐能力方面正起着越来越重要的作用。相关的研究表明,由高浓度的NaCl等盐分引起的植物氧化胁迫是非生物胁迫中一个非常重要的潜在因素。对于微生物和高等植物而言,代谢产物则是应对氧化胁迫的重要组成部分。在高盐胁迫条件下,植物体内SOD等酶的活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关,而且在盐分胁迫下,盐生植物与非盐生植物相比,其SOD、CAT、POD活性更高,因而更能有效地清除活性氧,防止膜脂过氧化。可溶性蛋白质可以缚更多的水,而水含量的增加也能避免或减少因细胞脱水引起的蛋白质变性[5],从而二者含量的提高均能有效提高植物对盐胁迫的耐受性。 烟草(Nicotiana tabacum)属于茄科烟草属植物,是我国重要的经济作物之一,种植面积很大,其产量最近几年均居世界首位。本实验选取转IrrE基因烟草作为研究对象,与野生型烟草进行比较,考察在200mmol/L NaCl胁迫下转IrrE基因烟草幼苗叶片中POD、SOD和CAT三种抗氧化酶活性、以及可溶性蛋白质含量和相对含水量的变化,为探明IrrE基因对NaCl胁迫的耐受性应答提供初步的生理生化证据。 1 材料与方法 1.1 植物材料,实验材料 F1代转IrrE烟草种子(K326)由本实验室保存。 1.2 酶、试剂、引物 Taq酶、Buffer购买于天根生物技术有限公司;PCR引物由英俊生物技术有限公司合成,序列如下:F 5-3’ CAACGTCATCCTCATCAACTC和R:5-3’ TCCACCTCCGCCTTCATTT。 1.3 转基因烟草种子的培养 选取籽粒饱满的烟草种子,4℃过夜春化,然后取出70%乙醇浸泡30s,2%的NaCl溶液浸泡8-10min,无菌水冲洗5-6次。黑暗中吸胀12h,将其置于蛭石和营养土(1:1)中培养(25±1)℃,光照12h,每天补充水2次。待幼苗长至3-4片叶后,选取大小一致的烟草幼苗,用200mmol/L NaCl的对烟草苗进行盐处理,分别在处理后0h、12h、24h、36h和48h时取样,重复3次,取其平均值。 1.4 植物总DNA提取 采用CTAB法提取烟草DNA,存于-20℃备用。 1.5 烟草转基因苗的PCR分析 取制备好的烟草总DNA,按以下反应程序进行扩增:94℃、3min;94℃、1min,55℃、1min,72℃、1min,30个循环;72℃10min。 1.6 叶片酶粗液的提取 称取约0.5g新鲜叶片,用0.05mol/L pH 7.0 磷酸缓冲液在冰浴下把叶片充分研磨成匀浆,匀浆液于4℃下,4000r/min离心20min。上清液即为粗酶提取液,分装后储存于-80℃冰箱中。 1.7 抗氧化酶活性的测定 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定参照邵丛本等的NBT光还原方法进行;过氧化物酶(POD)活性的测定按照的方法进行;过氧化氢酶(CAT)活性的测定按Beers和Sizer的方法进行。 1.8 叶片中可溶性蛋白质含量的测定 可溶性蛋白质含量用考马斯亮蓝G2250法测定。 1.9 叶片中相对含水量的测定 含水量测定参照张志良等的实验指南进行测定。 2 结果与分析 2.1 烟草转基因苗的PCR分析 将长至3-4片叶的烟草幼苗进行PCR鉴定,获得了21株转基因阳性烟草植株,部分转基因植株PCR电泳结果如图1。 图1 烟草幼苗转基因阳性植株的PCR鉴定 注:M表示DL 2000Marker;1-2表示阳性IrrE质粒PBI121-IrrE;3表示野生型烟草;4-11表示8株独立的转基因烟草植株。 2.2 NaCl