IrrE基因转化甘蓝型油菜及其分子检测.docVIP

IrrE基因转化甘蓝型油菜及其分子检测摘要：为提高油菜的盐胁迫的耐受性，文章以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）下胚轴为转化材料，通过农杆菌介导法将耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans，DR)的IrrE基因导入甘蓝型油菜84100-18（玻里马细胞质雄性不育恢复系）中，经过卡那霉素的筛选培养，获得了抗卡那霉素的再生植株，对抗性植株进行PCR和实时荧光定量PCR检测。结果表明：部分抗性植株多次重复检测显示为阳性植株，初步证实了IrrE已整合到油菜基因组中并且IrrE基因已经在这些植株中进行mRNA水平的转录。 关键词：甘蓝型油菜；遗传转化；PCR检测 中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0041-2 甘蓝型油菜（Brassica napus L.）属于十字花科芸苔属植物，是全世界较为重要的一种油料栽培作物。它作为重要的食用油来源及工业原料，在2000年度我国油菜籽进口量一度创下385.5万吨的历史最高纪录。扩大油菜种植面积，提高油菜产量已成为我国油菜生产的当务之急。但是，土壤的盐渍化已经使油菜产业的可持续发展受到严重阻碍，而油菜整个生长发育期中对盐胁迫都很敏感。因此，培育耐盐油菜品种是解决油菜生产的重要途径。 IrrE基因是耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)基因组中的一个突变基因(又命名为PprI)，是一个能够促进细胞体内RecA、PprA等直接参与DNA损伤修复基因表达的开关基因[1,2]。该基因表达的IrrE蛋白是DNA修复及保护途经的总开关，该基因在大肠杆菌（E.coli.）中为组成性表达，大肠杆菌能忍受 0.65 mol.L-1 NaCl胁迫，并能正常生长[3]。 为了增强油菜的盐耐受性，我们以来源于耐辐射异常球菌的IrrE基因为外源基因，以油菜下胚轴为转化材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法，对甘蓝型油菜进行转化，获得转IrrE基因的油菜。通过PCR技术进行阳性苗的分子鉴定，荧光实时定量PCR检测其转录水平的表达，结果表明IrrE基因已经成功导入甘蓝型油菜并在其中进行mRNA水平的转录。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 材料 转IrrE基因的大肠杆菌（Escherichia coli）IrrE-DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）IrrE-EHA105菌株由中国农业科学院植物生物技术研究中心微生物实验室提供。甘蓝型油菜（Brassica napus）84100-18（玻里马细胞质雄性不育恢复系）由四川大学遗传学实验室提供，在本实验室温室中栽种。 1.1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶，反转录试剂盒等均购自于均购自TaKaRa 公司，引物由上海生物工程公司合成，无DNA的RNA提取试剂盒购自于上海华舜生物有限公司，Cab由北京普博欣生物科技有限责任公司提供，kan由Bio BASIC INC 提供，利福平由成都锦华药业有限责任公司提供。 1.2 试验方法 1.2.1 根癌农杆菌介导油菜的遗传转化 选取籽粒饱满的油菜种子用无菌水浸泡10min，再用75%酒精消毒1min，用无菌水冲洗2-3次，在用1%的升汞消毒12min，用无菌水冲洗2-3次，接种于无激素的MS培养基上。光照培养5d，剪下油菜苗的子叶和生长点，取紧接生长点的约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基（含6-BA 2.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、AgNO3 2.5 mg/L、AS 100uM）上预培养培养2天。 在50ml LB培养基（含Rif 40mg/L、str 20mg/L、Kan 50mg/L）中加入0.1 ml IrrE-EHA105菌液，220rpm，28℃振荡培养过夜；室温下5000g，10min，弃上清液，菌体用MS液体培养基（含AS100uM）悬浮，再220rpm，28℃振荡培养1hr，使菌液的OD600=0.5左右。将经过预培养2天的下胚轴在农杆菌液中浸泡1 min ，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，23℃暗培养2d。共培养2天后的下胚轴接种至筛选培养基（6-BA 2.0mg/L、AgNO3 2.5mg/L、Kan 10mg/L、Cab 500mg/L）上筛选培养，每两周转继一次，经过4轮筛选培养，再生出小苗。再生小苗长有三片真叶时将其从愈伤组织上将其剪下，接种至含NAA 0.15mg/L和Cef 250mg/L的1/2MS培养基中生根。 1.2.2 转基因植株的PCR检测 采用CTAB法，分别从转基因植株和非转基因植株叶片中提取总DNA，用质粒提取试剂盒提