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Purification and Identification of Expressed Protein 第四章 表現蛋白質之純化與檢定 台灣大學生化科技學系 莊榮輝 表現目標基因得到蛋白質後，可以進行各種純化方法(蛋白質抽取、膠体過濾法、離 子交換法、親和層析法等) ，以便分離出目標蛋白質；同時並檢定其各種基本生化性質(如 蛋白質定量、酵素活性分析、膠体電泳、免疫轉印等) 。本章是以表現蛋白質GUS 為例， 說明其純化及檢定方法；因為各種蛋白質的性質差異很大，因此每種蛋白質都有其特定的 純化或檢定條件，必須個別去找出其自身的條件。本章整體實驗流程如圖4.1 所示。 4.1 蛋白質純化方法 利用蛋白質間生化特性的差異，可以分離並純化出各種蛋白質。純化蛋白質的方法 主要是以色層分析法進行，但是利用蛋白質分子物理或化學特性的沈澱方法，也是 相當簡單、有效而且經濟。 4.1.1 蛋白質抽取 蛋白質在細菌中表現後，以反覆的冷凍-解凍方法打破細胞，再用硫酸銨把蛋白 質沉澱下來，此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質等雜物。 儀器用具： 恆溫震盪培養箱37℃ 高速冷凍離心機及離心管(使用20,000 rpm離心陀) ◆ 使用高速離心機要注意： 離心機及離心陀的溫度要預冷完全，相對位置 的兩隻離心管要平衡好，離心陀轉速絕對不能超過最高速限。 液態氮及冰筒 37℃溫水浴 藥品試劑： 轉型菌株pQG11/M15 [pREP] 單一菌落 LB/amp/kan 及IPTG (1 M stock) Lysis buffer (50 mM Na PO ·12H O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2% 3 4 2 Triton X-100) ◆ 使用前添加成10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme 。 Buffer A-0 (50 mM Na PO , pH 7.0) 3 4 ◆ 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成為10 mM 最終濃度。 Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl 硫酸銨(要烘乾並以研砵磨碎) 生物技術方法 卷一 67 生物技術核心實驗 第四章 蛋白質純化檢定 Protein Purification 各實驗進行流程圖 Extraction Transformants 大量培養 XT 4.1.1 Ammonium sulfate TP