XVIII J-中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则.PDF

  1 附录ⅩⅧ J 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则   本法用于中药材(包括药材及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。 DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种 鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列 是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 四种碱基以不同顺序排列组成，因此 对一定长度的DNA序列进行分析即能够区分不同物种。 中药材DNA条形码分子鉴定是以核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)注1为主体条形 码序列鉴定中药材的方法体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，以叶绿体psbA-trnH 注2 为辅助序列，动物类中药材采用细胞色素c氧化酶亚基I(COI)注3为主体序列，ITS2为辅助序 列。 一、仪器的一般要求 所用仪器有电子天平、离心机、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)仪、 电泳仪和测序仪。 DNA 序列测定用测序仪，是一台具有自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自 动电脑控制的测定 DNA 片段中碱基顺序或大小，以及定量用精密仪器。测序方法主要采用 双脱氧链终止法，又称 Sanger 法，传统 Sanger 法采用同位素标记，目前常用的自动测序仪 是基于毛细管电泳和荧光标记技术的 DNA 测序仪，从而大大提高了 DNA 测序的速度和准 确性。4 种双脱氧核苷酸(ddNTP)的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管时，不 同长度的DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被电荷藕合元件 图像传感器(charge-coupled device，CCD)检测系统识别，并直接翻译成 DNA 序列，获得供 试品的峰图文件和序列文件。 测序仪的配置包括毛细管电泳仪、计算机、液晶显示器及数据采集和分析软件。仪器主 要具有进样、电泳、检测、清洗四大功能，其中进样部分的主要作用是放置待检测的样品； 起电泳功能的主要部件是毛细管和泵，在 60℃条件下电泳，区分不同长度的DNA 片段；检 测部件主要是激光电源、激光管、光电转换装置；清洗部分主要作用是对毛细管进样口的清 洗，保证自动灌胶、上样、电泳过程中无交叉污染。 二、 测定步骤                                                                1 新增指导原则。若正文品种采用该法，则按方法予以收载。    本法主要包括供试品处理、DNA提取、DNA条形码序列PCR扩增、电泳检测和序列测 定、序列拼接及结果判定，主要步骤如下。 1. 供试品处理 按药材和饮片取样法( 《中华人民共和国药典》附录IIA)取样，除另有规定外，药材和 饮片使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10-100 mg备用。具体见各药材项下。 2. DNA提取 DNA 的提取包括使用研钵或研磨仪破碎细胞，释放DNA ，用试剂盒法进行DNA 的分离 和纯化等步骤，目前常用试剂盒包括植物基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组 DNA提取试剂盒，实验选用的试剂盒须能够提取到满足后续实验要求的模板DNA 。 由于植物类中药材种类繁多，可根据所鉴定的中药材的具体情况对提取方法加以改进。 例如：植物细胞内含有大量多糖、多酚等次生代谢产物，这些物质在提取DNA 的过程中与 DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物，难以溶解或氧化产生褐变，严重影响DNA提取的产量与 质量，以及后续的PCR扩增实验。但如在提取DNA过程中加入抗氧化剂β-巯基乙醇，则可抑 制氧化反应，避免其褐化。再如：PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA提取过程中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。因此若将PVP和β-巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚 及多糖的污染。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能螯合Mg2+或Mn2+ ，从而抑制DNA酶(DNase) 活性，防止DNA被其降解；在天然状态下，DNA与蛋白质以DNA蛋白质复合物(DNP)的形 式存在，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种