《药学分子生物学》第三节原核细胞表达系统.docVIP

第三节原核细胞表达系统 *一个完整的表达系统通常包括配套的：一、表达载体（Expression vector）二、表达菌株 *表达载体(1) DNA复制及重组载体的选择系统(2)外源目的基因的转录系统：限速步骤。(3)蛋白质的翻译系统 外源目的基因的转录系统这一系统包括：抑制物基因；启动子(promoter, P）是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。由-10区（pribnow box）和 -35区组成。）；转录终止子。 启动子，分类 转录形式：组成型：如T7噬菌体的启动子；诱导型：如lac、trp等的启动子 强弱，取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。 启动子 启动子 -35 区序列 -10 区序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T λ噬菌体PL和PR；T7噬菌体启动子 P tac = 3 P trp = 11 P lac IPTG诱导启动子--Lac Lac表达系统：以大肠杆菌lac（乳糖）操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。 Lac转录调控机理：具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子CAP；负调节因子lac I Lac表达系统：正调节因子CAP：cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进 Plac介导的转录。 负调节因子lac I ：在无诱导物情形下， lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。 IAA诱导启动子--Trp，Trp 表达系统：以大肠杆菌trp（色氨酸）操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。 Trp转录调控机理 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。 在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达。 杂合启动子--Tac Tac表达系统 tac启动子是由trp的–35序列和 lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。 启动子 -35 区序列 -10 区序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T 温度诱导启动子--PL和PR PL和PR表达系统：以λ噬菌体早期转录启动子PL、 PR为核心构建的表达系统。在野生型λ噬菌体中，PL、PR启动子转录与否决定了λ噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI 857(ts) 的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30℃）时以活性形式存在。在较高温度（42℃）时失活脱落。 λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体，这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。 cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR?启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。 由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL 或PR 表达系统。 PL和PR表达系统存在的问题 缺陷：在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到 42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。 最常用启动子--T7 T7表达系统 大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。 T7噬菌体编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。 T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA 的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。 在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。 转录调控的机理*T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合