实验二生物芯片ppt20110418.pptVIP

实验目的 了解并掌握基因芯片技术的原理和方法 微阵列基因芯片进行细菌类别的鉴定 实验原理 微阵列基因芯片上印制有不同细菌的基因序列 通过PCR扩增这些细菌基因对应的核酸序列 标记后的PCR产物与基因芯片进行杂交 用微阵列芯片扫描仪对芯片进行扫描和数据分析 判别芯片上哪些基因发生了杂交作用 推测出PCR扩增的模板中含有哪些细菌 待鉴别菌种：大肠杆菌（Escherichia coli) 黄单胞菌（Xanthomonas campestris） 芯片：生物芯片北京国家工程研究中心（博奥生物）提供的实验 用细菌类别鉴定芯片 PCR扩增试剂：HEX荧光染料标记好的引物、酶、dNTP等 仪器：晶芯?EcoScan100微阵列芯片扫描仪、PCR仪、水浴锅、震荡器、电泳仪、台式离心机等 100%甲酰胺。 10%SDS。 20×SSC。 仪器：EcoScan-100芯片扫描仪、PCR仪、水浴锅、震荡器、台式离 心机等。 探针设计 选取大肠杆菌和黄单胞菌的各一个基因，这两个基因的核酸序列没有同源性 针对此基因各设计一对PCR扩增引物,引物的 5’端加上HEX荧光标记 操作方法 PCR扩增 以大肠杆菌和黄单胞菌培养的菌体分别为模板 用加荧光素标记的各菌对应一对引物对两种菌株分别进行PCR扩增 用凝胶电泳进行检测 标记样品PCR原理反应示意图 芯片制备 用不加荧光标记的引物进行PCR 扩增 得到的扩增产物用来点制到芯片上 在芯片上同时点上一系列的阳性和阴性对照 芯片的制备 利用化学方法处理，可以使玻璃基片表面富含氨基。氨基的正电荷与核酸磷酸骨架负电荷之间的静电吸引力可以使核酸吸附在玻片表面，并且在一定能量的紫外照射或加热条件下，核酸上的胸腺嘧啶碱基可以和氨基形成共价键。这样核酸就能够固定在玻璃基片表面。 芯片的预处理 将杂交围栏放在杂交膜具中心的同样形状的凹槽中 将芯片正面（贴有标签纸）朝下放入膜具 芯片正面朝上放入杂交盒中 按芯片摆放方向盖上盖片 配制杂交液(每个小组) 将以上四份12μl 杂交液用移混匀后，3000rpm 离心30s。 95°C ，热变性3 min。 冰浴骤冷1min。 用移液器将四份杂交液分别注入盖片上的四个小孔。 盖紧杂交盒盖，放入42°C水浴中，杂交2小时，使样品与探针充分反应。 芯片清洗 配置洗液，洗液I 2 × SSC，0.2% SDS 洗液II 0.2 × SSC（洗去残留的SDS） 将洗液 I、II 预热至42°C 杂交结束后，快速将芯片从杂交盒中拿出，将芯片转移到盛放洗液I 的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min。 在洗液I中清洗结束后，迅速用镊子芯片转移到盛放洗液II的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min。 芯片清洗后，放在50ml 锥形离心管中（标签纸端朝下），1500rpm离心1min，除去玻片表面的液体，此时的芯片可以进行扫描。 检测与数据处理 用晶芯?EcoScan 100微阵列芯片扫描仪进行检测 软件进行数据处理 来源于样品的核酸经过荧光标记之后，能够与玻璃基片上的核酸按照碱基配对原则杂交，形成稳定的双链。然后利用特定的光学系统，就能够检测到这些双链核酸，从而对样品进行分析。 实验结果 晶芯?EcoScan 100 生物芯片扫描仪 实验系统配套软件 思考问题 为什么杂交前要把PCR产物变性？ 每次清洗步骤的作用有什么不同？ 电泳和杂交都可用作检测PCR产物。这两种方法有什么不同？ 检测软件工作简单流程 微生物芯片检测的参考结果 * 实验二 基因芯片法鉴定大肠杆菌和黄单胞菌 清洗 对PCR产物进行荧光素标记 实验材料和用品 核酸杂交反应的分子生物学过程原理图 芯片制备原理示意图 实验流程和说明 去掉杂交围栏上的胶纸 将杂交围栏胶面朝上放在杂交模具中 将芯片放在杂交模具中 用镊子轻轻向下按，使 杂交围栏贴在芯片上 往杂交盒底部的凹槽中均匀加入少量蒸馏水 芯片放入杂交盒 按芯片摆放方向盖上盖片 芯片杂交 80.4μl 8.04μl 总体积 ×10＝18μl 1.8μl 3×SSC 3. 20×SSC ×10＝2.4μl 0.24μl 0.2%SDS 2. 10%SDS ×10＝60μl 6μl 50%甲酰胺 1. 100%甲酰胺 10个杂交反应用量 加样量(每个杂交反应) 终浓度 加入物 配制以下杂交液体系 杂交样品的处