7原核表达载体的构建.doc

《基因工程实验技术指导书》 浙江万里学院生物与环境学院 目 录 第一层次实验：基础综合实验 实验一 DNA酶切及凝胶电泳2 实验二 质粒DNA的分离和鉴定3 实验三 DNA酶切产物的纯化4 实验四 重组质粒的连接5 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及筛选7 实验六 PCR扩增技术8 第二层次实验：应用设计性实验 溶藻弧菌外膜蛋白OmpU的克隆与原核表达9 第一层次实验：基础综合实验 实验一 DNA酶切及凝胶电泳 实验目的：学习并掌握DNA酶切及电泳技术。 二、材料及设备 材料：λDNA，PUC19质粒、HindIII酶（EcoRI）及酶切缓冲液、琼脂糖、eppendorf离心管、离心管架、一次性手套、冰盒、泡沫板、200ml锥形瓶 试剂： 10×TBE电泳缓冲液：称取Tris54g,硼酸27.5g，并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml 6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液 EB溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹 设备：电泳装置、高速离心机、恒温水浴锅（烘箱）、移液枪、电炉、紫外透射仪、灭菌锅 三、操作步骤 1、酶切：经灭菌的eppendorf管编号——加1ug DNA和10×酶切缓冲液2 ul——加无菌水至总体积为19 ul——加1 ul酶液(计算好加入DNA、无菌水体积，加样顺序：无菌水、缓冲液、DNA、酶)——轻弹管壁使之混匀（或离心一下）——将离心管置于泡沫板，37℃水浴保温2-3小时——每管加2ul 0.1mol/L EDTA（pH=8.0）混匀停止反应 2、琼脂糖凝胶制备：称取1.6g琼脂糖置于250ml锥形瓶中——加入200ml 1×TBE稀释缓液——加热至琼脂熔化（加热时封口），摇匀——冷却至50-60℃后，加入EB，使其终浓度为0.5 ug/ml（50uL） 3、电泳分析：胶板制备（梳子齿下缘与胶槽底保持1mm）——加样（5ul酶解液+1.5uL6×上样液）——电泳（电压100V，电流40mA）——观察 四、结果分析 画出电泳图 实验二 酶切产物的提纯 一、实验目的：学习并掌握酚/氯仿法提纯DNA产物。 二、材料及设备 材料：λDNA酶切产物、PUC19质粒酶切产物 设备：冷冻离心机、移液枪 试剂：酚:氯仿:异戊醇=25：24：1 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，高压灭菌 95%乙醇、70％乙醇 三、实验步骤 取剩余反应产物15uL加50ul TE缓冲液——加等体积氯仿混匀，10000rpm离心15秒——用移液器将上层水相吸至新的小管中——再用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提，回收上层水相——在水相中加3倍体积预冷的无水乙醇，置-20℃下30min沉淀——12000rpm离心10min，吸净上清液——加入0.5ml 70％乙醇，稍离心后，吸净上清液——将沉淀溶于4uL ddH2O 中 实验三 重组质粒的连接 一、实验目的：学习质粒与外源DNA的重组连接技术 二、材料与设备 材料：纯化后外源DNA（λDNA）酶切产物、DNA载体（PUC19质粒）酶切产物、Eppendorf离心管、离心管架、一次性手套 设备：恒温水浴锅、恒温培养箱、移液枪 试剂：T4DNA连接酶、连接反应缓冲液 三、实验步骤 经灭菌的eppendorf管编号——加0.1ug 载体+等摩尔量（可稍多）外源DNA——加蒸馏水至体积为8ul，45℃保温5分钟，冷却至0℃——加10×连接酶1ul、连接酶0.5ul，混匀离心——16℃保温8-24小时 四、结果分析 实验四 JM菌株感受态细胞的制备和转化 一、实验目的：学习菌株感受态细胞的制备及转化方法 二、材料与设备 材料：JM菌株、Amp抗生素、重组质粒、Eppendorf离心管、离心管架、一次性手套 设备：恒温摇床、恒温培养箱、高速离心机、无菌工作台、恒温水浴锅、移液枪 试剂： LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCL10g，溶于800ml去离子水，用5MNaOH调pH至7.2－7.4，加水至总体积1L，灭菌。 LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，灭菌 Amp母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用 麦康凯选择培养基：取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解，高压灭菌，冷却至60℃左右加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀倒板 0．05mol/LCaCl2溶液：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml,高压灭菌 含15%甘油的0.05mol/L CaCl2：称取