生物制药综合实训技术复习重点.docVIP

复习指南 说明：考试为闭卷，题型分简答、问答和计算三种类型，考试时间1个小时。 1.实验室常用的消毒方法有物理灭菌法和化学灭菌法，请举出3种常用物理灭菌法，并简述灭菌原理及注意事项。 答：湿热灭菌：用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。酶分子活性中心的结构原来并非和底物的结构互相吻合，但酶的活性中心是柔软的而非刚性的。当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，有关的各个基因达 到正确的排列和定向，因而使酶和底物契合而结合成中间络合物，并引起底物发生反应。反应结束当产物从酶上脱落下来后，酶的活性中心又恢复了原来的构象。 微生物繁殖快，生长周期短，培养简便，并可通过控制条件提高产量 微生物具有较强的适应性，通过育种可以培育出新的高产菌株 微生物培养基来源广泛，价格便宜 可以采用微电脑等新技术控制酶发酵生产过程，使生产连续化、自动化、规模化 简单说明纤维素酶活力的定义 答：（根据中华人民共和国轻工行业标准QB2583-2003和中华人民共和国农业行业标准NY/T912-2004）：1g固体酶（或者1ml液体酶），在50℃（预设），PH4.8（预设）的条件下，1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U/g(或者U/ml)表示。简写成CMCA-DNS（羧甲基纤维素酶活力）。 几种固定化酶的方法及各自的优缺点 方法 优点 缺点 吸附法 制作条件温和、简便，成本低，载体再生、可反复使用 结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶装载容量一般较小 载体偶联法 载体与偶联方法可选择性大；酶结合力强，非常稳定 偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高；某些偶联试剂有一定的毒性 交联法 可用的交联剂多，技术简易 交联条件较激烈，机械性能较差 包埋法 酶结合力弱，稳定性较高；包埋材料、包埋方法可选余地大；包埋条件温和 仅可用于低相对分子质量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题，不是所有单体材料与试剂都适用于各种酶 17.纤维素酶活的测定 纤维素酶的酶活定义 答：（根据中华人民共和国轻工行业标准QB2583-2003和中华人民共和国农业行业标准NY/T912-2004）：1g固体酶（或者1ml液体酶），在50℃（预设），PH4.8（预设）的条件下，1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U/g(或者U/ml)表示。简写成CMCA-DNS（羧甲基纤维素酶活力）。 纤维素酶酶活测定的方法及其原理 答：纤维素酶在一定的温度和PH条件下，能够将纤维素底物（羧甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖可以与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的强度（吸光度OD值）与酶解产生的还原糖量成正比关系，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，可以通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。 纤维素酶酶活的测定过程 ①待测酶液的制备 称取固体酶样1g,精确到0.1mg(或吸取1.0mL酶液,精确到0.01mL),用水溶解,准确稀释定容成100×,500×,1000×,2000×,从中选取一个合适的稀释度,最终使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.33~0.35范围内),混匀放置10min,待测。 ② 实训操作过程 (1)取四支25mL刻度具塞试管(一支空白,三支样品管平行)； (2)分别向四支管中准确加入已经在50℃条件下预热了5min的用相应PH缓冲液配制的CMC-Na溶液(底物)2.00mL； (3)分别准确加入已经在50℃条件下预热了5min的稀释的待测酶液0.50mL于三支样品管中(空白管不加),充分混匀,盖塞； (4)将四支试管同时放入(50+0.1℃)水浴中,准确计时,反应30min,取出； (5)迅速准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL,于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL,充分摇匀.将四支试管同时放入沸水浴中,准确计时,加热10min,取出,迅速用流动冷水冷却至室温,用蒸馏水定容至25mL； (6)以空白管调节仪器零点,在分光光度计波长540nm下,用10mm比色杯,分别测量三支样品管样液的吸光度,取平均值.通过查标准曲线或用线形回归方程求出还原糖的含量。 纤维素酶酶活测定过程中出现的问题 答：a、待测酶液未配置好，影响结果 b、每支管加样量有微量差异，影响结果 c、需加热时，加热时间过短或过长，影响结果 d、加入试液不同步，有些管中已经在反应，有些却还没反应，影响结果 纤维