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人穿孔素和精子蛋白17放射诱导表达的实验研究
中文摘要 人穿孔素和精子蛋白17放射诱导表达 的实验研究 研究生：张春华 导师：李芳秋教授 张建琼教授 东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室 中文摘要 在生物学基础实验研究和疾病的基因治疗中常常需要对基因表达进行时空调控。早期生长反应 因子1(earlygrowth (motif)，可在电离辐射产生的氧自由基刺激下诱导下游基因的表达，从而实现对目的基因表达的时 cDNA连 空调控。我们利用Egr-I启动子的这一特性，分别将人穿孔素全长cDNA和人精子蛋白17 接到Egr-I启动子下游，构建成表达载体，对这2个基因进行了放射诱导表达研究。 一、穿孔素放射诱导表达体系的初步研究 挥着重要作用。PFN是糖基化蛋白，原核表达的PFN蛋白未能糖基化修饰可能对其活性有一定影响， 我们拟采用真核表达系统表达PFN蛋白，以期在体外研究PFN蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用。 1．穿孔素真核表达载体的构建和在COS7细胞中的表达。以带有人pfn全长cDNA的质粒 因序列与国外文献报道基本一致。用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3．1(+帅血转入COS7细胞。 这证明pfn在COS7细胞中有mRNA水平的表达，但用免疫细胞化学未能检测到蛋白的表达。 MIu I、gm mRNA，但用免疫细胞化学检测未见蛋白的表达。 转染pEgr-pfil的COS7细胞可检出pfn 二，人精子蛋白17基因的放射诱导表达 精子蛋白17(Spermprotein 17，Spl7)是一种保守的睾丸特异性蛋白，其功能主要是促进受精。 近年发现该蛋白基因在一些恶性肿瘤组织中被激活并高水平表达，是一种新的癌瘤-睾丸 断和治疗中具有潜在价值，有望成为肿瘤诊断的标志和免疫治疗的靶点，尤其是对于女性肿瘤患者。 为了利用Spl7作为靶标进行妇科肿瘤体内分子影像定位诊断和磁致过热治疗的实验研究，需要建 立表达spl7蛋白的卵巢癌细胞模型和动物模型，但目前尚无高表达spl7的卵巢癌细胞系。因此， 我们拟通过转基因技术将Spl7 胞模型。同时用Egr-1启动子替换表达载体的CMV启动子，进一步验证放射诱导基因表达的可行性。 1．构建人精子蛋白17放射诱导表达载体。以p／vIDl8T-Spl7质粒为模板，设计Spl7 基因的上下游引物，在其两端分别引入NheI和rpnI酶切位点，经NheI、rpn I双酶切消化的Spl7 DNA测序。测序结果证实Spl7基因序列完全正确，成功构建pEgr-Spl7质粒。 2．人精子蛋白17在卵巢癌H08910中的稳定表达。将重组质粒pEgr-Spl7转染人 后，继续用含G418500pg／mL的RPMI 1640培养细胞，筛选稳定表达Spl7的细胞株。经过约40d 选择培养进行检测，结果发现表达Spl7的细胞达50,．60％。 本试验成功构建2个放射诱导基因表达的载体，实现Spl7蛋白在卵巢癌细胞中稳定放射诱导表 达。 IV 中文摘要 关键词基因放射诱导表达，穿孔素。人精子蛋白17 V 英文摘要 The ofhuman and 17 empiricalstudy perf
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