实验二碱裂解法抽提质粒DNA-2.ppt

实验一、碱裂解法抽提质粒DNA 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。 质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。 本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用； 2、掌握常用分子生物学试剂的配制； 3、掌握无菌操作技术； 4、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法； 5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法； 6、学会根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。 一、实验目的 在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。 将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。 通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。 二、实验原理 1、 含有pBluescript II SK (+)(pSK)质粒载体的大肠杆菌菌株DH5α菌液 2、含有重组质粒 MP3的大肠杆菌菌株DH5α菌液 注：pBluescript是由Stratagene公司开发的噬菌粒载体（phagemid vector，由质粒载体和单链噬菌体的复制起点结合而成）。 重组质粒MP3是利用Hind III对水稻基因组DNA进行部分酶切（不完全酶切），然后与Hind III酶切的pSK（长约3kb）连接筛选得到的重组质粒，插入的水稻基因组DNA片段长约3kb。 三、实验材料 分子生物学常用的大肠杆菌（E. coli）菌株： DH5α：是世界上最常用的生物工程菌株之一，特别是在克隆应用方面；其主要特点是 ：高转化率、高稳定性、遗传标记多；是扩增菌，可使质粒高拷贝数扩增。 DH10B：was designed for the propagation of large insert DNA library clones. It is used extensively, taking advantage of properties such as high DNA transformation efficiency and maintenance of large plasmids. BL21：是表达菌，利于蛋白的表达。 该质粒载体用的是pUC的复制子，拷贝数能达到500-700个。 四、仪器设备 五、实验用具 高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床 恒温培养箱 干燥箱 台式离心机（冷冻式或非冷冻式） 旋涡振荡器 培养用试管 量筒 冰盒 微量离心管 移液器 吸管头若干 六、试剂 细菌培养用试剂 细菌裂解用试剂 质粒提取用试剂 核酸沉淀、纯化、溶解用试剂 注：配制时要把试剂粉末加入到水里，把水加到试剂里会造成结晶难溶。 七、实验步骤 （一）细菌的培养 （二）菌体的收集和裂解 （三）分离与纯化质粒DNA 1、取超低温与干有种保存的含有质粒的大肠杆菌菌液于固体 LB培养基上 划线，37 ℃倒置过夜培养至长出单菌落； 2、用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37 ℃摇床，200 r/min 过夜培养。 （一）细菌的培养 3、吸取 1.5 ml 菌液， 12000 rpm 离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；若菌体沉淀少，重复以上步骤再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4、加入 300 μl 溶液 I + 5 μl RNaseA （10 mg/ml）振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块），静置2分钟； 5、加入 250 μl 溶液 II ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过 5 分钟； 6、加入 180 μl 溶液 III 颠倒混匀，放置于冰上 10 分钟，使杂质充分沉淀； 7、12000 rpm离心10 分钟； （二）菌体的收集和裂解 8、吸取 约500-600 μl 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质，若有杂质，则上清12000 rpm离心5分钟后吸取上清）至另一 Eppendorf 管中；（记体积） 9、加入 2/3 体积的酚/氯仿上下颠倒抽提10分钟，室温下静置待分层后12000 rpm 离心 10分钟；（含有酚和氯仿的管子要盖好放于通风橱中） 10、移取