耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜20肽重组蛋白SA0587的表达和鉴定.pdfVIP

ChinJCellMolImmuno1)2016．32f9 1231 · 论著 · 文章编号：1007—8738(2016)09—1231—03 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜20肽重组蛋白SA0587的表达和鉴定 李振 ，崔凡 ，李 良怿 ，徐元宏 (安徽医科大学第一附属医院检验科，安徽 合肥230022；芜湖市第一人民医院，安徽 芜湖 241000) [摘 要] 目的 原核质粒表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)细胞膜 20肽重组蛋 白SA0587。方法 构建 pET28a． SA0587一GFP重组质粒，将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中；挑取单菌落培养活化后诱导表达 目的蛋白SA0587；SDS．PAGE 及 Westernblot法鉴定 SA0587蛋白。结果 利用基因工程技术成功构建重组质粒pET28a．SA0587．GFP，转染大肠杆菌后，成功 表达出目的蛋白SA0587。结论 成功在大肠杆菌表达 MRSA细胞膜20肽重组蛋白SA0587。 [关键词]重组蛋白；质粒；基因表达 【中图分类号]R392-33，Q786，R378 [文献标志码]A Koyama等 和Yoh等 发现一些IgA肾病 (IgA Westernblot及 IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethane— nephropathy，IgAN)患者的发病与耐甲氧西林金黄色 sulfonylfluoride，PMSF)、二辛可 宁酸 (bieinehoninicacid， 葡萄球 菌 (methicillin-resistantStaphylococcusalzFeus， BCA)蛋白浓度测定试剂盒购 自碧云天公司。Tween20购 自 国药集团化学试剂有限公司。HRP标记的抗金黄色葡萄球菌 MRSA)的感染有着密切的关系，并证实 MRSA上存 抗体购自Abeam公司。TC-XP-D型PCR仪购 自杭州博 日科 在一种特殊的抗原组分，这种抗原刺激人体产生相 技有限公司，SPECTRAmaxPlus384酶标仪购 自Molecular 应的抗体及一些细胞因子，形成一些抗原抗体复合 Devices公司。 物，进而引发IgAN。这种抗原就是 MRSA的细胞膜 1．2 方法 蛋白 J，并以此作为抗原免疫BALB／c小鼠，成功建 1．2．1 质粒的构建和鉴定 通过化学合成 的方式得到 立 IgAN模型。本研究 旨在对该抗原进行重组、构 SA0587．GFP融合蛋 白基因序列，并连接到pET28a原核表达 建、大量表达、纯化和鉴定 J，为进一步研究奠定 载体上 ；从SDS．PAGE融合蛋白序列中克隆得到GFP 基因 物质基础。 序列，同样连接到pET28a上。化合成由上海捷瑞生物工程有 限公司完成。根据PubMed数据库提供的目的基 因序列设计 l 材料和方法 引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，序列如下： 1．1 材料 GFP上游引物为 cArGccATGGcCAGTAAAGGAGAAGAA(下 XLIOGOLD感受态细胞、大肠埃希菌 pET28a由杭州赫 划 线 部 分 为 Nco I酶 切 位 点)，下 游 引 物 为： 贝公司提供。琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒和质粒小量提取 CCGCTCGAGITrGTATAGTYCATCCATG(下划线部分为XhoI 试剂盒购 自Axygen公司。分子生物学实验所用到的工具酶 酶切位点