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高表达稳定细胞株的构建 散丹 研发部项目经理 默克上游生物技术中心(北京) 生物工艺上游开发过程 1 5 放大生产 载体构建 • 放大方式 • 序列确定 • 一次性反应器 • 载体选择 2 细胞转染 4 工艺优化 • 密码子优化 • 培养基选择 • 培养基优化 3 细胞株构建 • 工艺优化 •…… • 宿主细胞选择 • 基因扩增 • 亚克隆 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 序列优化 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 真核表达载体 启动子 (CMV, SV40, CHEF1) MCS PolyA (BGH polyA, SV40 polyA) 增强子 细菌复制起点 细菌系统选择标记 哺乳动物系统选择标记 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 哺乳动物细胞筛选系统 抗生素 • G418 • Puromycin • Hygromycin B • Zeocin 代谢酶 (基因扩增) • 二氢叶酸还原酶(DHFR) • 谷氨酰胺合成酶(GS) 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 随机整合到哺乳细胞中 DNA 双螺旋 高度压缩的异染色质 染色体 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 获得高表达的克隆是费时费力 人工 高通量自动筛选 Screen 5000 clones to ensure get high producer 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 DHFR 和GS 表达系统周期比较 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 细胞株筛选的标准 生长稳定 生产出的产品生物活性稳定 在整个生产周期内分泌水平稳定 生产出的产品质量好 易放大 高表达稳定细胞株的构建/29th.March.2017 其他提高产量的方法 定点整合 Cre-LoxP FLP-FRT ZFN CRISPR 特殊的染色体元件 染色质绝缘元件(
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