第八章 QIAamp DNA Mini-从细胞中纯化DNA.pdfVIP

Sample Assay Technologies QIAamp® DNA Mini-从细胞从细胞中纯化中纯化DNA 从从细胞细胞中纯化中纯化 2012年04月 胡川 Sample Assay Technologies 注意事项注意事项：： 注意事项注意事项：： 所有离心步骤在室温（15–25°C ）下完成 涡旋时需短暂离心5-10 s 操作步骤第一步需要配置PBS （pH 7.2，50 mM potassium phosphate，150 mM NaCl），不需要使用Buffer ATL 可选操作：RNase A消化的步骤 准备准备事项事项：： 准备准备事项事项：： 若Buffer AL发生沉淀，可在56°C 水浴锅中水浴将其融解 Buffer AW1，AW2 以浓缩液的形式提供。在使用前，加入适量体积的乙醇(96–100%)至 瓶身标注的位置。在盖紧盖子的情况下，可以在室温下储存1年。 预热振荡水浴装置或其他振荡加热设备：设置56°C 以备第2步使用 QIAamp® DNA Mini-从细胞从细胞中中纯化纯化DNA 2 从从细胞细胞中中纯化纯化 Sample Assay Technologies 操作流程操作流程：： 操作流程操作流程：： 6 1.将培养的细胞将培养的细胞 （最多（最多5 x 10 ）在）在300 x g下离心下离心5 min 。将沉淀在。将沉淀在200 µl PBS 将培养的细胞将培养的细胞 （（最多最多 ））在在 下离心下离心 。。将沉淀在将沉淀在 下重悬浮下重悬浮。加入。加入20 µl proteinase K。继续第。继续第2步操作步操作。。 下重悬浮下重悬浮。。加入加入 。。继续第继续第 步操作步操作。。 如果起始样本是冰冻的细胞，待细胞融解，至轻柔弹击管壁可将细胞移出时，加入PBS。 确保细胞的数量适中。对于一些倍数程度较高的细胞系（e.g., HeLa cells ），细胞的数量 务必要低于5 x 106 。 可选操作：如果需要获得无RNA的g DNA样本，在开始第2步操作前，加入4 µl RNase A (100 mg/ml)，涡旋振荡，室温下孵育2 min 。 2. 加入加入200 µl Buffer AL （用前摇匀（用前摇匀，此步还未加入乙醇，此步还未加入乙醇）。）。涡旋混匀涡旋混匀，，56°C 加入加入 （（用前摇匀用前摇匀，，此步还未加入乙醇此步还未加入乙醇）。）。涡旋混匀涡旋混匀，， 下孵育下孵育10 min。。 下孵育下孵育 。。 确保还未加入乙醇。 通过涡旋振荡或者吸打，立即将样品和Buffer AL彻底混匀为匀浆。 3. 加入加入200 µl 乙醇乙醇(96–100%) ，涡旋混匀，涡旋混匀。。 加入加入 乙醇乙醇 ，，涡旋混匀涡旋混匀。。 将样品和乙醇混匀为匀浆非常重要。 QIAamp® DNA Mini-从细胞从细胞中中纯化纯化DNA 3 从从细胞细胞中中纯化纯化 Sample Assay Technologies 4. 将柱子放在一个将柱子放在一个2 ml 的收集管内的收集管内，将第，将第3步获得的混合液加到柱子上去步获得的混合液加到柱子上去。。6000 x 将柱子放在一个将柱子放在一个 的收集管内的收集管内，，将第将第 步获得的混合液加到柱子上去步获得的混合液加到柱子上去。。 g (8000 rpm)下离心下离心1 min。丢弃收集管。丢弃收集管。。 下离心下离心 。。丢弃收集管丢弃收集管。。 5. 将柱子放在一个新的将柱子放在一个新的2 m