无菌检查方法学验证实验08年11月.ppt

无菌检查法及《中国药典》2005年版无菌检查法中方法验证试验 2005版 《中国药典》 张春华 一·无菌检查法 1.基本定义 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 2·需进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围 各种注射剂 眼用及外伤用制剂 植入剂 可吸收的止血剂 外用敷料、器材 3·环境要求及无菌操作 环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域 一般要求 18～26℃ 45％～65％ 例行消毒处理 洁净度检查 阳性实验室、检查间分离。 无菌操作 防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；有效避免操作者自身被微生物感染。 无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室 。 4·仪器及设备 无菌室内常备器具 恒温培养箱、生化培养箱 离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等 玻璃器皿 无菌衣，裤，帽，口罩 除菌滤器及滤膜 其他用具：手术剪、镊、接种环、酒精灯、微波炉、电子天平、洗耳球、纱布、牛皮纸、棉线绳等。 洁净间的日常监测 浮游菌 沉降菌 营养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基 是固体培养基，在液体培养基中添加1%～2%的琼脂作为凝固剂。45℃以上时为液态培养基，使用时需在水浴中保存 。 营养肉汤培养基、改良马丁培养基。 表面活性剂，中和剂。 一般采用商品脱水培养基 洁净玻璃器皿 纯水 培养基的pH应符合规定 分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理 培养基的储存:2～25℃、避光环境，可保存三周左右 稀释剂 1. 0.9%氯化钠溶液：常用的等渗溶液。 2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌数及控制菌测定。 3. 0.1%蛋白胨水溶液。 培养基的装量 培养基的适用性检查 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检查 培养基的灵敏度检查 取每管装量不少于12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各2支。另1支不接种作为空白对照，培养3天；每管装量不少于9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 6·试验用菌株及菌液制备 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 菌种的要求： 不得超过5代。采用适宜的方法保存。   《中国药典》2005年无菌检查和微生物限度检查的验证试验中使用7株菌见表1：  表1 7株菌的培养条件 菌种 接种培养基 培养温度℃ 培养时间 金黄色葡萄球菌 30～35 18～24h 铜绿假单孢菌 营养肉汤或者普通 枯草芽孢杆菌 斜面 大肠埃希菌 生孢梭菌 硫乙醇酸盐培养基 白色念珠菌 改良马丁或者普通 23～28 24～48h 斜面 黑曲霉 改良马丁斜面 23～28 5～7d 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿