牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌 HECB细胞凋亡及其机制论文.docVIP

　　牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌 HECB细胞凋亡及其机制论文 田彦玲，王玉花 ， 程建新，刘京生 【摘要】 目的 观察牛黄天龙胶囊（含药血清）对人子宫内膜癌HECB细胞能否诱导凋亡并对其抗癌机制进行探讨。方法 实验组分低、中、高3个剂量组并设空白组和阳性对照组进行含药血清的制备；MTT法观察细胞毒作用；细胞排染法观察瘤细胞直接损害实验；吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色法及电镜（TEM）下观察细胞凋亡的形态学变化；流式细胞术（FCM）测定细胞凋亡率并进行细胞周期 分析，测定凋亡抑制蛋白survivin和凋亡效应蛋白Caspase3的表达。结果 MTT法：人子宫内膜癌HECB细胞经含药血清作用后细胞生长受到明显抑制且以低剂量组抑制率最高。细胞排染法：同一时间段内以低剂量组效果最好，不同时间段内（24、48h）细胞抑制率显著提高(P 0.01)。AO/EB和TEM：实验组均可见到典型细胞凋亡的形态学变化。FCM：实验组各组细胞凋亡率与空白组相比差异有显著性(P 0.01)且以低剂量组最高，细胞周期分析显示实验组G0/ G1期细胞明显增多而S期细胞明显减少与空白组相比差异有显著性(P 0.01)，Survivin蛋白表达在空白组最高.freelacology; Cell apoptosis; AO/EB double fluorescent dye staining; Transmission electron microscope；Floetry 大量研究表明，复方中药制剂可通过阻滞肿瘤细胞生长周期，影响癌基因和抑癌基因表达等途径发挥抗癌活性1。我们所用方剂“牛黄天龙胶囊”，是在传统抗肿瘤中药方剂“犀黄丸”2基础上添加了新的抗肿瘤中药成分，针对妇科肿瘤而研制的新的抗癌组方。本研究运用血清药理学方法从细胞、分子和基因水平对牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌HECB凋亡的作用机制进行了初步探讨，旨在为筛选有效的抗妇科肿瘤的中药方剂提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 I1640培养基为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶，丫啶橙（AO），溴化乙啶（EB）由美国Sigma公司提供；胎牛血清由河北医科大学第四医院科研中心提供；顺铂（冻干型）购自山东省德州制药厂，产品批号031001；CO2培养箱，美国Forma Scientific公司产品；倒置相差显微镜（XS2D2型），荧光显微镜（Nikon UFXⅡ型）均购自日本Olympus公司；透射电子显微镜为日本日立H7500；流式细胞仪420为美国B．D公司产品。 1.5 方法 1.5.1 含药血清的制备3,4 将40只I1640培养基中，在37℃，5% CO2，95%湿度条件下的培养箱中贴壁生长，以按0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 1∶1比例配置的消化酶消化，3d传一代。实验分组：将制得的5组含药血清即空白组、高、中、低实验组和阳性对照顺铂组分别加入PRMI培养基中，使各培养基的血清终浓度为10%5。 1.5.3 细胞抑制率的检测（MTT法）6 取对数生长期的细胞，以1∶10.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，制成单细胞悬液，再以2.0×104/ml浓度接种于96孔板，每孔200μl，实验分5组，即空白组、高、中、低实验组和阳性对照（顺铂）组，每组设4个复孔并设空白调零孔（除不加细胞外，余处理与其他各组相同）。将已接种HECB细胞的培养板置于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养24h，待细胞进入对数生长期，弃去原培养基以PBS液洗两遍，然后依次更换含10%药物血清的PRMI1640培养基，置培养箱中分别培养24h和48h。取出培养板，向每孔加入MTT20μl，继续培养4h后终止培养，小心吸去孔内上清液，每孔加入DMSO 150μl，在微量震荡器震荡15min，使结晶物充分溶解之后在酶联免疫检测仪490nm处读取各孔光密度值（OD值）。瘤细胞抑制率=空白组平均光密度值－实验组平均光密度值/空白组平均光密度值。 1.5.4 吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色法观察HECB细胞凋亡的形态学变化8 取对数生长期的细胞消化制成单细胞悬液以2×105/ml接种于6孔板，每孔2ml，每组设4个复孔。将培养板置于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养24h，细胞贴壁后弃原培养基，更换含10%药物血清的PRMI1640培养基，继续培养48h。分别消化制成1.0×106/ml的细胞悬液，取100μl受检细胞悬液加入4.0μl上述染液轻轻吹打均匀后取细胞悬液一滴滴在洁净的载波片上，加盖玻片后立即置于荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化并摄片。 1.5.5 透射电镜（TEM）观察HECB细胞凋亡的