熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响论文.docVIP

　　熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响论文 刘志芳，田萌，马跃文，李政，李黎，刘克武 【摘要】 目的研究熊果酸（UA）和齐墩果酸（OA）对胰脂肪酶（LPS）活性和构象的影响。方法采用紫外光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱法分析UA和OA作用后LPS相应图谱的特征。结果UA和OA作用后LPS的活性明显降低，紫外吸收光谱发生改变。荧光淬灭结果显示UA作用后，LPS的荧光发生淬灭.freela公司；其余试剂均为国产分析纯。 2 方法 2.1 UA，OA对LPS活性的影响 2.1.1 UA，OA对LPS的抑制作用酶活性测定采用铜皂法［5］。 2.1.2 UA，OA对LPS的抑制动力学研究 在酶的反应体系中分别加入不同浓度的UA和OA，改变底物橄榄油的浓度，测定酶促反应的初速度。以Linel浓度为1×10-5 mol/L的LPS溶液，分别加入不同微量体积的UA和OA（1.0×10-3 mol/L）溶液，使三萜类小分子与LPS的终摩尔比分别为0／1，0.2／1，0.4／1，0.6／1，0.8／1，1／1，3／1，5／1。混合均匀后，室温放置10 min，以相同浓度的小分子溶液作空白，记录 200～300 nm的紫外吸收光谱。 以295nm为激发波长，室温下测定300～400 nm的荧光光谱，溶液浓度及反应条件同上述。 2.2.2 圆二色(CD)谱测定 样品池光程为0.1 cm ,在室温下测定波长范围190～250 nm的CD谱。CD谱用平均残基摩尔椭圆度表示，单位为deg ·cm2 ·mol -1 ，数据经3次扫描取平均值。得出CD谱后, 用该仪器附带的杨氏方法软件计算脂肪酶的二级结构含量。LPS浓度为1 ×10-5 mol/L，实验时三萜类小分子与LPS的终摩尔比为0／1，0.4／1，3／1。 3 结果与讨论 3.1 UA，OA对LPS活性的影响 不同浓度的UA，OA对LPS活力的影响结果见图1。由图1可以看出，UA，OA对LPS都有一定的抑制作用，抑制作用随UA，OA浓度的升高而增强。在相同浓度下，UA的抑制作用大于OA。 3.2 UA，OA对LPS的抑制 动力学UA，OA对LPS的抑制作用如图2。由图可知随着UA，OA浓度的升高，酶的Km值保持不变，而Vmax则随UA，OA浓度的升高而不断降低。因此UA、OA对LPS均属于非竞争性抑制。 采用Dixon作图法，以1/V对不同浓度的UA，OA作图，可得到UA，OA的抑制常数Ki。UA，OA的Ki分别为0.6 mmol/L，0.46 mmol/L，可见抑制作用UA大于OA。 3.3 不同浓度UA，OA对LPS的紫外吸收差谱 大多数蛋白质分子在280 nm附近有一个吸收峰，是由于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳杂环对光的吸收；同时在220 nm左右有一个由肽键的C=O的π-π跃迁引起的强吸收峰，与蛋白质的α-螺旋含量有关［7］。 用不同浓度的UA，OA作用于LPS的紫外吸收差谱如图3。可知LPS在270 nm和220 nm附近出现最大吸收峰，且随UA、OA浓度的增加LPS在220 nm 和270 nm附近的吸收不断增大，图3A中最大吸收都有少许红移。在低浓度时，酶在220 nm 和270 nm附近的吸收随浓度的增加而急剧增加，当UA与酶的比例达到1/1后，紫外吸收增幅减慢。因此可以认为UA与LPS的摩尔比例为1/1时，具有最大紫外吸收。图3B中OA作用后的LPS最大吸收峰发生红移，当OA与酶的比例达到3/1后，紫外吸收增幅明显减慢。因此可以认为OA与LPS的摩尔比例为3/1时，具有最大紫外吸收。 从由不同浓度的UA、OA作用后LPS的紫外吸收差谱可见，LPS270nm和280nm附近的吸收主要是由于肽键C=O基的π-π＊跃迁所引起，与蛋白质的α-螺旋含量有关［6］。当UA、OA浓度较低时，这些小分子与LPS的结合有利于酶分子间和分子内的团聚作用，使包围在LPS分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来,改变了芳香族氨基酸残基在空间结构中所处的微环境使蛋白质分子的构象发生改变，α螺旋含量减少；当小分子浓度进一步升高时，UA处理后的LPS分子发生蛋白质肽链伸展现象，使酶分子中疏水作用略有增强，吸收峰略增加且略有红移［7］，因此在紫外差谱中酶的最大吸收增加明显减缓，并产生红移。而OA没有红移现象，表明UA与酶的结合对酶构象的影响较OA大。 3.4 不同浓度UA，OA对LPS的荧光光谱的影响 蛋白质中芳香氨基酸的荧光特性可用来推测蛋白质的溶液构象，提供有关蛋白质生色基团的结构及所处微观环境的信息。蛋白质分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有荧光性质，此蛋白质内源荧光可作为探针检测蛋白质构象变化