在电泳时.PPT

血清蛋白质的醋酸纤维素薄膜电泳 影响电泳速度的因素 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度 对流免疫电泳技术 电渗作用：由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，向负极移动。 如果物质带负电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的γ球蛋白就是如此 。 在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗体球蛋白不但不能抵抗电渗作用向正极移动，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质则带负电荷，向正极移动。 对流免疫电泳技术 将抗原置于负极，将血清抗体置于正极，电泳后则在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 电泳方法分类 按电场分 常压（500V，适用大分子） 高压（500V，适用小分子） 按支持体分 自由电泳 支持物电泳：如醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂(糖)电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽） 醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳(cellulose acetate membrane electrophoresis)以醋酸纤维素薄膜为支持物。 醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。 将醋酸纤维素溶于丙酮等有机溶液中，可涂布成均一细密的微孔薄膜。待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。 该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 醋酸纤维素薄膜的优点 (1)醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，分离的各种蛋白质染色带清晰，本底低，定量测定的精确性高。 (2)快速省时。电渗作用小，分离速度快，一般电泳45~60 min即可 。 (3)灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μl血清，甚至少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的区带。 (4)醋酸纤维素薄膜电泳染色后，可制成透明干膜，用于定量扫描分析与长期保存。 (5)醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。 染色方法 蛋白质染色 氨基黑10B： 氨基黑10B是酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应形成复合盐，是最常见的蛋白质染料之一。 考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝G250 银染色法 实验目的 掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能 熟悉电泳的基本过程 实验原理 血清中各种蛋白质的等电点不同，在同一高于其等电点的pH值缓冲液中，它们都带负电荷，但电荷数量不同。同时，各种蛋白质的分子大小不一，所以在同一电场的电泳迁移率不同。 人血浆蛋白质的等电点及迁移率 临床意义 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常可分离白蛋白(Alb)、α1、α2、β和γ-球蛋白五个组分，正常人血清中各种蛋白质浓度的差别较大，所以在许多疾病时仅表现出轻微变化，往往没有特异的临床诊断价值。 分析几种疾病的电泳分析结果，可以看出较显著的变化。 典型异常血清蛋白电泳图谱 在异常电泳图谱中，肾病综合征、肝硬化和多发性骨髓瘤(M蛋白血症型)最具有特征性，在临床上诊断意义最大。 几种疾病的蛋白电泳变化 实验器材和试剂 实验器材： 电泳槽、电泳仪、染缸、滤纸、醋酸纤维素薄膜、点样器 样品：血清、上次实验中纯化的白蛋白溶液 试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6、I=0.06) 氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。 漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。 实验操作流程 薄膜的准备 电泳槽的准备 点样 电泳 染色、漂洗、脱色 电泳槽的准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极室内，使正负极室的液面等高，电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。 （4）电泳 每次电泳后应交换电极，使两侧电泳槽内缓冲液的正、负离子相互交换，使缓冲液的pH值维持在一定水平。 电泳槽缓冲液的液面要保持一定高度，电泳槽两测的液面应保持同一水平面 。 电泳失败的原因 电泳图不整齐：点样不均匀，薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发、缓冲液变质；电泳时薄膜放置不正确使电流方向不平行。 蛋白各组分分离不佳：点样过多、电流过低、薄膜结构过分细密、透水性差、导电差等引起。 染色后白蛋白中间着色浅：由于染色时间不足或染色液陈旧所致。 结果与讨论 标示膜条上分离得到的各个蛋白及正、负极，分析各蛋白含量顺序及本组白蛋白的纯化效果。 绘制实验装置图 下周实验 血清丙氨酸氨基转移酶（AL