判断PCR产物的特异性.PPTVIP

东胜创新生物科技有限公司Eastwin Life Science inc. 2002年4月成立,专注于生命科学领域的高科技公司 总部设于北京，在全国16个主要城市设有分支，销售及售后服务网络覆盖全国 致力于为客户提供高技术、高质量、全方位的专业服务 拥有自主研发中心 东胜创新实验技术有限公司Eastwin Scientific,Inc. SYBR Green I SYBR Green I的稀释 原液10倍稀释于DMSO，可长期储存 使用前100倍稀释于纯水 SYBR Green I的保存 SYBR Green I的原液十分稳定 稀释后-20度可保存半年 避光，避免反复冻融 SYBR Green I试剂盒 Bio-Rad Finnzyme Qiagen等 不同读板温度对实验结果的影响：72℃ 不同读板温度对实验结果的影响：82℃ 内标引入的必要性 取材差异 提取效率差异 反转录效率差异 转基因油菜籽 非转基因油菜籽 配成转基因油菜籽含量分别为0.1%、 0.5%、 1.0%、 2.0%、 5.0%的标准系列 提取DNA，定量 不同体积比混合 转基因定量标准品的制备 分析结果 标准曲线 样品分析 肿瘤与耐药性 实验背景 药物：Gemcitabine是脱氧胞嘧啶（C）的类似物 ， 它的代谢物二磷酸Gemcitabine（dFd-CDP ） 可抑制DNA的合成。 细胞系：RL-7 正常淋巴瘤细胞系 RL-G 耐药淋巴瘤细胞系 突破点：研究相关因子在两个细胞系中的 表达量差异 与Gemcitabine转运相关的因子及细胞内靶点 Gemcitabine的活化以及降解因子 脱氧胞嘧啶激酶（dCK）：使Gemcitabine磷酸化 进一步研究 BMC Pharmacology 2004, 4:8 从病人血液样品中提取 DNA 基因型分类： A/A (Allele 1) G/G (Allele 2) G/A (Heterozygote) C F Q T V Q 基因型分析 VIC FAM VIC FAM SNP检测-基因型分析 VIC FAM FAM VIC T V Q C F Q A/A (Allele 1) G/G (Allele 2) G/A (Heterozygote) 甲基化检测 DNA 与SNP检测原理类似 基因启动子序列中一个CpG则可能会有2种结果： CG和TG。 未甲基化的C碱基突变为T 甲基化的C碱基则不改变 亚硫酸氢盐 盐处理法 检测方法示意图 盐处理法 甲基化检测 酶切法 MspI位点特异性酶切，不管甲基化与否 二恶英检测 金标准方法：高效气相色谱－质谱联用（GC/MS) 昂贵、费时、费力 酶切保护荧光定量PCR法 Molecular Beacons 优缺点 有很高的特异性， 用于SNP检测 荧光背景低 设计困难 一个探针只能用于检测一个特定的目标 价格较贵 TaqMan探针 探针 荧光素 淬灭剂 TaqMan 水解型杂交探针 TaqMan探针工作原理 3’ 3’ 5’ 5’ TaqMan 应用范围 鉴定PCR产物(定性） 定量起始模板浓度 单核苷酸多态性（SNP）检测 TaqMan 优缺点 特异性好， 适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比设计相对简单 价格较高 一个探针只能用于检测一个特定的目标 背景比分子信标探针高 荧光化学试剂总结 结合于双链DNA的小沟中 发夹型杂交探针 水解型杂交探针（5‘-3’外切） 延伸 复性 任何 步骤 定量 融解曲线分析 SNP分析 定量、定性 SNP分析 定量、定性 信号检测 工作原理 有否淬灭剂 化学试剂 否 有 有 主要应用范围 荧光定量实验体系的建立 使用SYBR Green I染料 常规PCR体系 SGI 荧光定量PCR体系 标准曲线如何制作 PCR产物、质粒DNA OD260定量 分子量计算 拷贝数换算 10倍系列稀释液 1. 94 ℃ 5 min 2. 95 ℃ 10 sec 3. 58 ℃ 30 sec 4. 72 ℃ 20 sec 5. Plate read 6. 82 ℃ 30 sec 7. Plate read 8. Goto step 2 for more 39 times 9. Perform melting curve from 55.0 ℃ to 95.0 ℃,read every 0.2 ℃, hold for 1 sec SYBR Gree