致犊牛肺炎和关节炎牛支原体诊断方法的建立.pdfVIP

摘 要 III 牛支原体（Mycoplasmabovis，M.bovis）是一种可导致牛发生肺炎、关节炎、乳房 炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流产与不孕等多种疾病的重要致病性病原体，在 环境等其他应激因素的作用下还可引起多种疾病的继发感染。自 1961 年 Hale 在美国首 次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原后，其他国家也相继发现并暴发了由该病原引起的 牛支原体病，我国自 2008 年开始以湖北省为首的不同地区也相继暴发了牛支原体疫情， 目前该病在世界范围内广泛存在，发病率和死亡率较高，每年因该病给世界养牛业带来 的经济损失巨大，严重影响和制约着各国养牛业的发展。因此，建立快速准确的检测方 法对于该病的诊断和防治有重要意义。 本研究在牛支原体新疆分离株分离鉴定完成的基础上，分别从病原学、血清学及分 子生物学角度出发建立了三种不同的快速检测方法，以期更加全面、准确地对该病作出 诊断。本论文的研究结论如下： 1.M.bovis间接免疫酶标组织化学方法的建立。分别以鸡抗 M.bovisIgY、羊抗鸡 IgG-HRP 为一抗和二抗，对牛支原体菌体涂片、牛支原体阳性肺组织切片进行免疫组化染色，通 过条件优化，建立了 M.bovis间接免疫组化检测方法，用该方法对病死犊牛病料进行检 测，并以细菌分离培养和 PCR 方法进行验证，检测结果与分离培养和 PCR 结果一致， 具有特异性和可靠性。 2.M.bovis间接 ELISA 检测方法的建立。以 M.bovis全菌体蛋白经超声波裂解后的裂解 物作为包被用抗原，通过棋盘滴定法确定抗原的最适包被浓度为 200ug/mL，待检血清 最佳稀释度为 1:100，同时对抗原的包被方式、酶标二抗最佳工作浓度、一抗和二抗最 佳作用时间等进行了优化，建立了检测 M.bovis血清抗体的间接 ELISA 方法，用该方法 检测牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻粘膜病抗血清均无交叉反应，表明该间接 ELISA 具 有很好的特异性。 3.基于牛支原体 P81 基因环介导等温扩增方法的建立及与巢式 PCR 灵敏度的比较。根 据 GeneBank 中登录的 M.bovisP81 基因序列设计特异性引物，通过条件优化，建立了 M.bovis环介导等温扩增（LAMP）检测方法。将该方法的灵敏度与巢式 PCR 进行对比， 并用其检测牛支原体外的其他几种病原菌，同时对疑似感染 M.bovis的临床病料进行检 3 测。该方法的灵敏度比巢式 PCR 高 10 倍，最低检出限为 1.1fg/uL，对其他几种病原菌 的检测结果均为阴性，临床病料检测结果与分离培养符合率为 100%。 关键词：牛支原体；诊断方法；免疫组化；间接 ELISA；LAMP 研究类型：B（应用研究） Abstract Mycoplasma bovis (M.bovis) is an important pathogenic pathogens,it can cause bovine IV pneumonia, arthritis, mastitis, corneal conjunctivitis, ear infections, reproductive tract inflammation and even miscarriage and infertility.It can also cause a variety of diseases secondary infection under the environment and other stress factors.Since 1961 Hale isolated this pathogen from mastitis milk for the first time in the United States, other countries have also found and broken out Mycoplasma bovis disease caused by this pathogen. In different regions of