乳及乳制品中青霉素酶的测定方法 - 检验检疫标准管理信息系统.docVIP

前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中国检验检疫科学院、宁波出入境检验检疫局、西南大学。 本标准主要起草人： 乳及乳制品中青霉素酶的测定方法 范围 本标准规定了牛奶及奶制品中β-内酰胺酶的微生物学测定方法（杯碟法）。 本标准适用于 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所用的修改单）适用于本文件。 GB/T 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 6682 规定的一级水。 标准菌株：藤黄微球菌 （Micrococcus luteus）CMCC（B）28001传代次数不得超过14次。 脱脂奶粉或牛体乳 0.1 mol/L Tris-HCl 溶液（PH 7.0，含0.1% BSA），按附录A中A1配制。 磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）青霉素G标准品：纯度 ( 99 % ；英文名称：Benzylpenicillin Potassium G tetrahydrate； CAS：41372-02-5；相对分子质量：981.18；分子式：C48H56N6O8S2·4H2O；青霉素G标准品溶液：称取10 mg青霉素G标准品粉末，用定容至100 mL，浓度为100 μg/mL。 β-内酰胺酶标准品 英文名称：Penicillinase；CAS：9001-74-5 β-内酰胺酶标准品溶液：用1 mL溶解1KUβ-内酰胺酶标准品粉末，配制成浓度为1 KU/mL β-内酰胺酶标准溶液（4℃保存3周），根据需要量用奶液稀释成浓度为0.02 IU/mL的β-内酰胺酶标准工作溶液。 舒巴坦 纯度：0.994 mg/mg；英文名称：Sulbactam；CAS：68373-14-8；相对分子质量：233.24；分子式：C8H11NO5S舒巴坦溶液：精确称取100 mg舒巴坦，用定容50 mL，浓度为2 mg/mL。营养琼脂脑心浸液培养基 抗生素检定培养基Ⅱ号（低pH） 0.2 μm滤膜（low protein-binding）天平（感量0.0001g）。 振荡器 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃。 高压灭菌器。 麦氏比浊仪或标准比浊管。 pH计。 抑菌圈测量仪或测量尺（游标卡尺）。 无菌培养皿 内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。 无菌牛津杯：外径(8.0士0.1) mm，内径(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。 无菌吸管：1 mL（0.01 mL刻度值），10 mL（0.1 mL刻度值）。 加样器5 μL～20 μL，20 μL～200 μL,200 μL～1000 μL及配套吸头。 将藤黄微球菌划线接种于营养琼脂平板上，经36士1℃培养18 h～24 h至长出单菌落，4℃保存，贮存期限4周。 挑单菌落于灭菌的5 m脑心浸液中，经36士1℃培养18 h～24 h至菌液浑浊，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×109 CFU/mL，可供当天使用。 检测用平板的制备 菌悬液按1：20加入到无菌的大约50℃抗生素检定培养基Ⅱ号中，充分摇匀。取90 mm无菌培养皿，加10 mL～15 mL菌的抗生素检定培养基Ⅱ号凝固后在其表面放置4个无菌牛津杯，备用。 样品的制备 将待检样品充分混匀，取1 mL待检样品置于1.5 mL-离心管中，共4管，分别标为：A、B、C、D，每个样品做三个平行，共12管。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，应调节pH值至6～7。 同时，每次检测应做阳性质控对照和阴性对照。阳性质控对照样品为灭菌后并经检测为阴性的脱脂奶或牛体乳，添加β-内酰胺酶标准品至终浓度为0.0005 IU/mL。阴性对照样品为灭菌后的阴性脱脂奶或牛体乳。制备操作同待检样品。 样品的测定 按照下列顺序分别将青霉素G标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样品及阳性/阴性对照样品中： A 青霉素G 5 μL B 青霉素G 5 μL 舒巴坦 25 μL C 青霉素G 5 μL β-内酰胺酶 25 μL D 青霉素G 5 μL 舒巴坦 25 μL β-内酰胺酶 25 μL 混匀后，将上述A～D试样各200 μL加入放置于检测用平板上的4个无菌牛津杯中，36士1℃培养18 h～22 h，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。 结果判定 对照组： 阴性对照组：A、B、D产生抑菌圈，且A、B抑菌圈直径差异＜3 mm，重复性良好；C抑菌圈直径小于D抑菌圈，且抑菌圈直径差异≥3 mm，重复性良好。 阳性添加对照组：B、D产生抑菌圈，且