第章 电泳法.pptVIP

1．RNA染色法 (2)甲苯胺蓝0(toluidine blue O) 其最适浓度为0.7％，染色效果较焦宁Y稍差些。 (3)次甲基蓝(methylene blue) 染色效果不如焦宁Y和甲苯胺蓝O，检出灵敏度较差，一般在5μg以上；染色后RNA条带宽，且不稳定，时间长，易褪色。但次甲基蓝易得到，溶解性能好，所以较常用。 (4)吖啶橙(acridine orange) 染色效果不太理想，本底颜色深，不易脱掉，但能区别单链或双链核酸(DNA，RNA)，对双链核酸显绿色荧光(530 nm)，对单链核酸显红色荧光(640nm)。 1．RNA染色法 (5)荧光染料溴乙锭(ethidium bromide，EB) 可用于观察琼脂糖电泳中的RNA、DNA带。EB能插入核酸分子中碱基对之间，使DNA和RNA在紫外灯下显示较强的荧光。如将已染色的凝胶浸泡在1mmol／L MgSO4溶液中1 h，可以降低未结合的EB引起的背景荧光，对检测极少量的DNA有利。 EB染料具有下列优点：操作简单，凝胶可用1～0．5μg／mL的EB染色，染色时间取决于凝胶浓度，低于1％琼脂糖的凝胶、染15 min即可。多余的EB不干扰在紫外灯下检测荧光；染色后不会使核酸断裂，因此可将染料直接加到核酸样品中，以便随时用紫外灯追踪检查；灵敏度高，对1ng RNA，DNA均可显色。EB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。 溴乙锭(EB)染色 溴化乙锭(EB)分子具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对之间，所以对线状分子与开环分子的形状变化影响都较小，而对超螺旋状态的分子影响较大。 当DNA中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态(原始状)的分子开始向共价闭合环状转变，这时电泳的迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速度又由慢向快转变。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1～0.5μg／mL，现在我们电泳时所加入EB的终质量浓度也正是在此范围。电泳时，加入EB对线状、开环分子也会造成影响，将使迁移加快。3种构型分子的速率增加有所不同，超螺旋增加最多，其次是线型，开环增加最少。 2．DNA染色法 除了EB染色最常用外，还有以下几种方法。 （1）甲基绿(methyl green) 一般将O.25％甲基绿溶于O.2 mol／L pH4.1的乙酯缓冲液中，用氯仿抽提至无紫色，将含DNA的凝胶浸入，室温下染色1小时即可显色，此法适用于检测天然DNA。 （2）Feulgen染色 用此法染色前，应将凝胶用1 mol／L HCl固定，然后用Schiff试剂在室温下染色，这是组织化学中鉴定DNA的方法。 第六节、毛细管电泳 定义： 毛细管电泳是在散热效率极高的、空芯的、微小内径（10-200μm）的毛细管内进行的大、小分子高效分离技术。 目前用的是高效毛细管电泳 3、 结构流程 具有分流和尾吹装置 4. 毛细管电泳仪基本结构图 毛细管： 长：47cm, 57cm, 67cm; 直径：5-200 μm 进样系统：气压进样、电压进样。 冷却系统: 液冷、风冷。 高压系统: 1-30kV。 毛细管电泳的检测器：紫外检测器、二极管阵列检测器、激光诱发荧光检测器、电化学检测器、质量（质谱）检测器等。 5. 毛细管电泳的分类 1、毛细管区带电泳（CZE） 2、分子体积排除（筛滤）电泳或 凝胶电泳（CGE） 3、等电聚焦电泳（IEF） 4、胶束电动力学电泳（MECC） 5、等速聚焦电泳（ITP） 6. 毛细管电泳的主要优点 1、高灵敏度 2、高分辨 3、速度快 4、进样少 5、成本低 高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间，荧光检测可达10-19—10-21mol 高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔板数，一般可达几十万。 速度快：许多分析在10分钟内完成。 进样少：一般需要毫微升的进样量。 成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。 毛细管电泳的应用选择 小型离子 小分子 肽类 蛋白质 低聚核苷酸 DNA CZE MECC CZE CZE CGE CGE ITP CZE MECC CGE MECC ITP IEF IEF CGE ITP