第三章 酶的制备与纯化.pptVIP

2.1 细胞壁的组成和破碎阻力 微生物细胞的破碎技术 细胞破碎主要方法 机械破碎法与非机械法比较 破碎方法选择原则 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 丙酮?乙醇?甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 3. 有机溶剂沉淀法 优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2） 有机溶剂易燃、易爆 （三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1.原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 2. 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。 3. 优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化 4. 缺点： 酸化时，容易引起蛋白质失活 （四） 反胶团萃取 1. 反胶团：又称反胶束（Reversed Micelles） 指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机 溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。 2. 优点 1）萃取率和反萃取率高。 2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。 3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。 4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。 5）成本低。 1. 基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。 （三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。 （四）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 原理：利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。 第三节 电泳 电泳（electrophoresis, EP） ： 指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。 一、电泳的基本理论 1. 原理: 在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 化学分析法优缺点 优点：不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。 缺点：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。 （1）一般的连续法 使溶液中的溶质由液相转变为固相析出，古老、实用、简单的初步分离方法，在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵。 主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20度时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。 PEG-400最适合来做软胶囊。由于PEG400为液体、它具有与各种溶剂的广泛相容性，是很好的溶剂和增溶剂，被广泛用于液体制剂，如口服液、滴眼液等。当植物油不适合作活性物配料载体时，PEG则是首选材料。这主要是由于PEG稳定、不易变质，含有PEG的针剂被加热到150摄氏度时是很