猪脾中dna的提取及含量测定.ppt

猪脾中DNA的提取 指导教师：滕利荣 Email:tenglirong@mail.jlu.edu.cn 2005.03 二十世纪是 DNA提取的意义： 1、用于研制核酸类药物及保健品 2、用于基因诱变 3、用于DNA克隆 4、用于DNA测序 5、用于PCR扩增 提取DNA的主要来源： 1、动物组织及器官 脾、肝、胸腺、鱼类精子等。 2、植物 种子的胚芽等 3、微生物 细菌、酵母菌等 核酸的存在形式： 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在； 真核生物的染色体DNA为双链线性分子； 原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子； 有些噬菌体DNA有时为单链环状分子； 病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。 核酸的分布： 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。 RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。 1、核酸的理化性质 DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。 核酸和核苷酸 大都呈酸味（除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外）。 DNA、RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP 表示； DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。 DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。 从不同材料中提取DNA的方法不同，分离提取的难易程度也不同。 从高等动植物及细菌中提取DNA难度大一些。由于其DNA 分子量较大。因此易被机械张力剪断。 细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。 对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 核酸提取的主要步骤： 1）破碎细胞； 2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子； 3）去除其它不需要的核酸分子； 4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质。 核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。 对于某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 2.细胞的破碎 有坚硬的细胞壁的细胞，首先要破碎细胞。方法有三种： ①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 高等动物的DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）： 1）破碎细胞难，从处死动物分离组织器官到破碎细胞费时长。在长时间内DNA可能会被DNase降解； 2）因分子量大，在使用组织匀浆器破碎组织时易造成DNA 断裂； 对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。 3.DNA提取的几种方法 (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液; 2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化; 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中; 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. （2）阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。 （3）苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。 用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。