电子显微镜.doc

著名的两个发现 1924年，法国科学家De.Broglie(德．布罗利)证明了任何一种粒子，当它们在快速运动的时候，必定都伴随有一定频率电磁辐射，辐射波的波长与粒子的质量及粒子运动的速度成反比。 1926年，德国科学家Busuch（布施）在射线研究中发现，高速运动的电子在电场或磁场的作用下会发生折射，并且能被汇聚，就如同普通的可见光通过光学透镜折射聚焦一样。 电子显微镜可基本定义为是一种以电子束为光源，以电磁透镜聚焦和放大成像的，具有极高大倍率和分辨率的显微镜。 透射电子显微镜主要由镜筒系统、电子光学系统、操作系统、真空系统和冷却循环系统组成。 透射电子显微镜的基本成像原理 透射电子显微镜是一种利用透射电子放大成像的光学设备光源是电子束，透镜为电磁透镜，整个成像光路的内介质为高真空环境。电子束与样品的相互作用照明电子束高能、高速、高密 获得电子束光源需要特定的条件：高真空、高电压。 电磁透镜有五部分构成：物镜（OBJ）、两级中间透镜、两级投影镜 放大倍数的模式包括：常规放大倍数(ZOOM)、扫描普查(SCAN)、选区观察(SA)和低倍放大(Low Mag) 分辨率(R)：是指电子显微镜分辨本领的极限值，包括晶格分辨率和点分辨率 亮度/亮度中心：亮度，调节光斑大小，及调节光斑强度；亮度中心，调节光斑位置，不调节光斑强度 电镜常规操作：开机预抽、观察操作、关机操作三个阶段 透射电子显微镜与光学显微镜的比较 光源部分 可见光；电子束（钨丝加热，高电压，高真空） 成像部分 物镜和目镜（玻璃）；电磁透镜（物镜，两级中间镜，两级投影镜；循环冷却系统） 观察系统 人眼可直接观察，或相机直接拍摄；荧光屏（信号转换）、相机和胶片（高真空操作）扫描电子显微镜的基本结构 （1）电子光学系统 a. 电子枪 b. 电磁透镜 c. 扫描系统 (2）电子信号的收集、处理和显示系统 a. 信号的种类b. 信号的收集和处理系统 c. 信号的显示与记录系统 (3) 真空系统 扫描电子显微镜的基本成像原理 从电子枪发出的直径20~30μm的电子束，受到阴极和阳极之间的1~40KV加速电压的作用，以极高的速度射向精细的电子通道，形成初级电子束。初级电子束经过第一、第二级聚光镜及物镜(末透镜)的汇聚作用，缩小成直径几十?的电子探针。在末透镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。 这些电子信号被相应的检测器俘获，经过放大、转换，将最初的光信号转换成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上作光栅状扫描，且这种扫描运动于样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样显像管受信号电压调制形成了反映样品表面特征的图像。这就是衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子图像。由此可见，扫描电子显微镜的成像原理不同于透射电子显微镜，它没有成像透镜系统，代之的是闭路电视成像系统。扫描电子显微镜的成像原理见图。 S250-MKIII 基本操作简介 开机操作（接通电源和启动真空系统）2、常规校正操作 3、聚焦 4、样品的放入和取出 5关机操作 电镜冷却系统包括：冷却水循环装置、整机冷却管道样品制备技术中所要解决的三个主要问题 电子束的特点 穿透能力有限，细胞直径大于其穿透能力，无法研究它的内部结构—超薄切片技术 生物组织的特性 水分的存在在高真空的环境中会使得结构发生变化，不能代表其真实结构，污染镜筒 电子成像的机制 在透射电子显微镜中，电子像的反差主要是由于样品散射电子能力之间的差别造成的。但是构成生物样品的元素，如碳、氢、氧、氮、磷；这些元素之间散射电子的能力相差无几，所以说生物样品的固有反差总是很弱，观察起来会感到十分困难。 超薄切片制作过程：也包括取材、固定（双固定）、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。厚度在10-100nm之间 取材：要求（快，最大限度保存组织在生活状态下的结构；小，不超过1mm3；准；干净，锋利） 固定：尽可能的保存组织细胞内的结构以及细胞内各种成分之间的相互关系，把超微结构改变控制在最小范围内固定方式：A 浸泡固定 前固定（一般使用醛类固定剂）→缓冲液洗涤→后固定（一般使用四氧化锇）→缓冲液洗涤 它适用于一些能允许在短时间内停止供血仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。 B 灌注固定血液固定一些取材比较复杂或对缺氧比较敏感的器官或组织等 C 培养细胞的固定 实验室常规固定方法：使用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛初步固定后再使用四氧化锇后固定的双重化学固定对大多数动物和植物组织都十分有效 固定剂：四氧化锇优缺点：优点：A对脂类糖类以及蛋白的固定作用都很明显，弥补醛类对脂类固定的不足；B据电子染色作用，膜结构