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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白 实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的操作技术（基础性很强，使用范围广泛）； 学习蛋白质的考马斯亮蓝染色鉴定。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶: 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用； 样品用量少，灵敏度可达10-6g; 凝胶孔径可调节； 分辨率高。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）； 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了原蛋白质分子的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此，可以利用SDS测定蛋白质分子量。 实验原理 浓缩效应 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成: 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1; 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8的Tris-HC1; 电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。 浓缩效应-1（凝胶孔径的不连续性） 浓缩效应-2（缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 ） 在pH6.8的凝胶缓冲体系中： 前导离子或快离子：HCl (解离）→Cl－，Cl－泳动速度最快; 尾随离子(trailing ion)或慢离子： CH2(NH2)COOH → CH2(NH2)COO－，泳动速度最慢; 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间； 电泳时，Cl－超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P压缩成层； mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯离子，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根离子)，有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度。 当进入pH8.8的分离胶时 甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质时，不再形成高电压。 实验原理 考马斯亮蓝是一种染料，和蛋白质结合呈蓝色。 G250用来测定蛋白质含量；R250用来对电泳条带染色。 SDS实验方法 分离胶的制备 置小烧杯中,混匀,迅速用移液器滴入二块玻璃板之间(短玻璃朝外),凝胶加至横板的2/3； 用滴管加少许水，在室温中聚合20-30分钟。 注意：acr/bis有神经毒/制胶时避免产生气泡 浓缩胶的制备 加样 样品制备：取大肠杆菌培养物1ml，6000rpm离心5分钟，弃上清，用100ul蒸馏水重悬，加25ulloading buffer沸水煮沸5分钟，10000rpm离心5min； 聚合后，将凝胶板取出，置于电泳槽中，短玻璃朝内，加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳，用微量进样器吸取10ul样品，加入凝胶的每个凹槽中。 注意：加样前先倒入电泳缓冲液，没过短玻璃；上样时不要扎破加样孔，也要避免样品溢出。 电泳 在电泳槽中注入Tris-甘氨酸缓冲液，样品端接负极(短玻璃的一边)，电压控制在180V，电泳约1～1.5小时,溴酚蓝距离分离胶底端1cm。 染色和脱色 染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色30min； 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色20min，更换脱色液过夜 。 ※剥胶时要小心，保持胶完好无损 结果观察 思考题 样品为什么会在浓缩胶内被压缩成狭窄的 一条带？ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质的什么性质将其分离？ 在不连续体系PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?使凝胶形成时有一水平面。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。 LOGO * 实验六 O O O CH2 = CH—C—NH2 + CH2 = CH—C—NH—CH2—NH—C—CH = CH2 (Acr) (Bis) （聚丙烯酰胺） 实验原理 凝胶系统的分类 连续性凝胶电泳 不连续凝胶电